Практическая заметка

AUC против SEC: действительно ли в образце тот 1%, что указан в отчёте?

28 сентября 2026 г. · Чтение ≈ 8 минут

SEC — основной метод контроля агрегатов, но он видит лишь ту часть образца, которая прошла через колонку и не изменилась при этом. Аналитическое ультрацентрифугирование (AUC) не использует ни колонки, ни стандартов и разделяет молекулы по первым принципам прямо в исходном буфере — именно поэтому регуляторы и отрасль применяют его как ортогональную проверку SEC.

1. «Проблем нет» по SEC — не значит, что их действительно нет

SEC (эксклюзионная хроматография) — рутинный метод анализа агрегатов: быстрый, высокопроизводительный и воспроизводимый, позволяет обнаруживать агрегаты на уровне 0,1% и является основой разработки и контроля качества^[4]. Однако его результаты изначально несут четыре смещения:

Четыре смещения, скрытые в рутинной работе

Разведение: Разведение до и внутри колонки может диссоциировать обратимо ассоциированные димеры^[9].
Подвижная фаза: Для хорошей формы пиков в SEC часто применяют подвижные фазы с высокой ионной силой, отличающиеся от лекарственной формуляции, — распределение форм при этом меняется^[4],[9].
Взаимодействие со стационарной фазой: Неспецифическое взаимодействие образца с сорбентом может как индуцировать новую агрегацию, так и задерживать исходные агрегаты на колонке^[5],[9].
Диапазон разделения: Диапазон разделения обычных SEC-колонок ограничен.

У последнего пункта есть чёткая граница: SEC по сути является фильтрацией, и агрегаты крупнее примерно 40–60 нм обычно не проходят сквозь слой сорбента^[4],[5]. «1% в отчёте SEC» не означает «1% в образце» — возможно, это лишь та доля, которую пропустила данная колонка. Поэтому результаты SEC следует сверять с выходом образца^[4].

Терминологическая граница　«Обнаружение» в SEC ограничено диапазоном разделения сорбента; агрегаты крупнее верхнего предела пор отфильтровываются и не попадают в детектор, поэтому «не обнаружено» ≠ «отсутствует».

Рис. 1. Ни один метод не покрывает весь диапазон размеров. SEC видит лишь ту часть, которую пропускает колонка; у SV-AUC нет слоя сорбента, и наноразмерные агрегаты целиком попадают в одно распределение (светлый участок — более крупные формы, для которых нужно изменить скорость ротора). Схема; границы размеров — по классификации Narhi и соавт. и литературе [4], [9], границы методов — типичные значения.

Ортогональность — не административное требование, а физика

Руководство FDA по оценке иммуногенности терапевтических белков рекомендует применять методы, которые по отдельности или в комбинации повышают выявление агрегатов^[1]; ICH Q6B относит молекулярную массу, размер и агрегаты к физико-химическим свойствам и требует их разделения и количественного определения^[2]; Фармакопея КНР (2020, том III, общая статья о рекомбинантных моноклональных антителах) также относит варианты по размеру к обязательным показателям^[3].

Отраслевой консенсус: количественное определение агрегатов должно вестись по классам размеров и опираться минимум на два ортогональных метода — ведь стандартных образцов агрегатов не существует, и любой отдельный метод покрывает лишь ограниченный диапазон размеров, а концентрацию в каждом диапазоне должен подтверждать метод на другом принципе измерения^[4],[6].

Есть и опубликованная методическая база: Национальный институт контроля пищевых продуктов и лекарственных средств КНР (NIFDC) опубликовал работу по созданию и валидации SV-AUC-метода определения вариантов моноклональных антител по размеру с оптимизацией скорости ротора, температуры и параметров обработки данных и системной оценкой специфичности, повторяемости, прецизионности и линейности^[7]. Полные данные методической валидации предоставляются по запросу.

2. AUC: забег без дорожки

Физическая картина AUC предельно проста: приложить центробежное поле, в реальном времени наблюдать перераспределение макромолекул в пространстве и количественно анализировать данные от первых принципов. Без меток, без химической модификации, без контакта с какой-либо матрицей или стационарной фазой — что особенно бережно для чувствительных к возмущениям систем^[9],[11].

Рис. 2. Аналитическое ультрацентрифугирование: разделение в растворе, без колонки и меток. Оптическая система многократно сканирует кювету во время центрифугирования, регистрируя концентрацию по радиусу и времени; компоненты разделяются естественным образом по коэффициенту седиментации (зависящему от массы, формы и плотности). Схема, не в масштабе.

Два режима: как быстро тонет или где оседает

Седиментационная скорость (SV-AUC) отслеживает границу седиментации на высокой скорости ротора и прямым фиттингом уравнения Ламма даёт непрерывное распределение коэффициентов седиментации c(s)^[8], разделяя компоненты по s — это и профиль состава, и низкоразрешённая структурная информация (коэффициент трения). Седиментационное равновесие (SE-AUC) на меньшей скорости ждёт баланса седиментации и диффузии и по равновесному профилю концентрации напрямую даёт абсолютную молекулярную массу и константу связывания K_D^[9],[11].

Параметр	Седиментационная скорость (SV-AUC)	Седиментационное равновесие (SE-AUC)
Условия	Высокая скорость, слежение за седиментацией	Меньшая скорость, ожидание равновесного распределения
Объект наблюдения	Смещение границы седиментации во времени	Распределение концентрации в равновесии
Основной результат	Распределение коэффициентов седиментации, доли компонентов	Абсолютная молекулярная масса, константы связывания, стехиометрия
На что отвечает	Что в образце и в каких долях	Какова молекулярная масса и насколько прочно связывание
Типичные задачи	Количественный анализ агрегатов, олигомерное состояние, ортогональная проверка SEC	Подтверждение ММ, термодинамика взаимодействий

Таблица 1 | Режимы независимы по постановке эксперимента и анализу данных: сначала решите, что нужно — «распределение» или «аффинность», затем выбирайте режим.

Проще говоря: SV — это когда пловцы разной комплекции одновременно входят в воду и мы смотрим, кто тонет быстрее; SE — когда все остановились и мы смотрим, на какой глубине каждый завис. Один измеряет, как быстро оседают, другой — где оказались в конце.

Рис. 3. Формы исходных данных двух режимов. A: в SV граница смещается ко дну кюветы со временем — её скорость даёт коэффициент седиментации, уширение — диффузию, а фиттинг c(s) превращает это в распределение компонентов. B: в SE седиментация и диффузия приходят в равновесие, концентрация экспоненциально растёт по радиусу, и форма кривой зависит только от молекулярной массы и взаимодействий, но не от формы молекулы.

3. Параметры, список задач и три заблуждения

Параметры для повторного использования (подтверждены валидацией)

Параметр	Значение	Обоснование
Скорость ротора	50 000 об/мин	Скорость из методической оптимизации [7]
Температура	20 °C	Температура из методической оптимизации [7]
Оптика / длина волны	УФ / 280 нм	Многоволновой сбор позволяет различать сигналы белка и нуклеиновых кислот [7]
Разрешение сетки c(s)	150	Resolution = 150 [7]
Диапазон s	0,1 – 20 S	Верхняя граница s_max = 20 S [7]

Таблица 2 | Параметры взяты из опубликованной валидации SV-AUC-метода [7] и могут служить стартовой точкой для аналогичных методик; формуляции с сахарами/полиолами и высококонцентрированные образцы требуют отдельной оценки [9], [10].

За этими условиями стоит полный пакет валидации: повторяемость RSD 0,91% в 6 экспериментах, общая прецизионность RSD 0,78%, хорошая линейность в диапазоне 0,2–0,8 мг/мл^[7].

SV-AUC предъявляет данные по специфичности, повторяемости, прецизионности и линейности — это не исследовательский инструмент «посмотреть», а аналитический метод, который можно включать в регистрационное досье и который выдерживает вопросы экспертизы; опубликованы лучшие практики валидации SV-AUC в рамках ICH Q2^[10].

Рис. 4. Распределение c(s) образца mAb по SV-AUC (иллюстрация). Один эксперимент показывает на одной оси фрагменты, мономер, димер и более крупные агрегаты; интеграл каждого пика — относительная доля; значимость малых пиков оценивают, например, F-статистикой [9].

Какие вопросы можно передать AUC

Вопросы для решений: Проверка достоверности результатов SEC; подтверждение олигомерного состояния и стехиометрии; взаимодействия и константы связывания K_D; оценка склонности к агрегации при подборе формуляции; ортогональные данные для стабильности выпуска, изменений и сопоставления с оригинатором.
Типы образцов: мАт / биспецифические антитела / слиянные белки; пептиды (агонисты GLP-1-рецепторов); вирусные векторы (AAV / VLP — многоволновая оптика одновременно разрешает пустые, частично заполненные и полные частицы и оценивает содержание нуклеиновой кислоты); ADC; коллаген и другие неантительные белки.

Тип образца	На какие вопросы отвечает
мАт / биспецифические / слиянные белки	Агрегаты, фрагменты, межсерийная воспроизводимость, подбор буфера формуляции, проверка результатов SEC
Пептиды (агонисты GLP-1-рецепторов)	Неоднородность чистоты, оценка склонности к агрегации, валидация методов для регистрации в США
Вирусные векторы (AAV / VLP)	Многоволновое разрешение пустых / частичных / полных частиц с оценкой содержания нуклеиновой кислоты; контроль агрегатов
ADC	Варианты по размеру и агрегация после введения гидрофобной нагрузки; ортогональное подтверждение атрибутов конъюгации
Коллаген и другие неантительные белки	Анализ агрегатов и состояния сборки в условиях, близких к исходным
Белок-белковые взаимодействия / комплексы с НК	Соотношение антиген–антитело, K_D лиганд–рецептор, комплексы белок–нуклеиновая кислота

Таблица 3 | Список сценариев — обзор области услуг; применимость к конкретному образцу подтверждается методической оценкой.

Три распространённых заблуждения

Заблуждение 1: «SEC уже измерил агрегаты — AUC это дублирование»

Механизмы разделения и состояние образца у методов разные: у AUC нет стационарной фазы, измерение идёт в буфере формуляции и видны компоненты, которые колонка SEC не пропускает. AUC — это перепроверка SEC, а не повтор^[1],[9],[10].

Заблуждение 2: «AUC — это просто измерение молекулярной массы»

SV фокусируется на распределении компонентов, SE — на молекулярной массе и термодинамических параметрах; постановка эксперимента и обработка данных полностью различны^[11].

Заблуждение 3: «Цифры двух методов не сходятся — значит, эксперимент плохо сделан»

Как раз наоборот: расхождение само по себе ключевое — особенно в стрессовых образцах (нагрев, перемешивание, встряхивание), где SEC и SV-AUC часто расходятся, указывая на компоненты, не восстановленные в SEC; это диагностический сигнал, требующий расследования^[4],[9].

4. Quickgene: услуги и результаты по AUC

Наша платформа аналитического ультрацентрифугирования покрывает создание методик, полную методическую валидацию, рутинные измерения и фиттинг данных — все этапы апробированы в регистрационных проектах. Представительные работы:

Регистрация пептидных препаратов в США: полная валидация SV-AUC-методов для семаглутида, тирзепатида и др. (специфичность, прецизионность, правильность, предел количественного определения, линейность и диапазон, робастность);
Выпускной контроль AAV: различение и количественное определение пустых / частично заполненных / полных частиц, контроль агрегатов — полная валидация передана заказчику;
BLA-заявки антительных препаратов: создание и валидация SV-AUC-методов для вариантов по размеру в поддержку регистрационного досье;
Характеризация ADC: оценка вариантов по размеру и агрегации после введения гидрофобной нагрузки, ортогональное подтверждение атрибутов конъюгации вместе с хромато-масс-спектрометрией;
Коллаген и другие рекомбинантные белки: анализ агрегатов и состояния сборки в условиях, близких к исходным.

Стандартные результаты: графики c(s), количественные доли компонентов, молекулярная масса или константы связывания (в зависимости от режима), отчёты по методике и результатам, а также протоколы и отчёты валидации по требованиям ICH.

Агрегация — атрибут качества, который до конца не раскрывает ни одна колонка. Верните образец в его собственный буфер и дайте ему один раз осесть в поле центрифуги по первым принципам — часто это дополняет ту часть ответа, которую «SEC не может объяснить».

Если результаты SEC по вашему проекту оспариваются, данных для сопоставления с оригинатором недостаточно, или агрегация и доля пустых капсидов пептидов/AAV требуют ортогональных данных — свяжитесь с нами. Сроки и стоимость — по письму на [email protected] или через онлайн-запрос.

AUC в трёх фразах

Это измерение «на месте»: без стационарной фазы, меток и стандартов — молекулы видны такими, какие они в растворе, поэтому SEC получает независимое второе мнение.
Сначала вопрос, потом режим: SV отвечает на «распределение и доли», SE — на «молекулярную массу и аффинность». Эксперимент определяется вопросом, а не прибором.
Это перепроверка, а не замена: подходит для проверки ключевых образцов и разбора спорных данных; с учётом времени анализа и требований к образцу рутинный высокопроизводительный контроль остаётся за SEC.

Литература

U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products. CDER/CBER, August 2014. fda.gov/media/85017/download
ICH. Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. Step 4, March 1999.
国家药典委员会. 中华人民共和国药典（2020 年版）三部：人用重组单克隆抗体制品总论. 北京：中国医药科技出版社, 2020. (Фармакопея КНР, 2020, том III — общая статья о рекомбинантных моноклональных антителах для человека.)
Uchiyama S. Aggregates Quantification of Biopharmaceuticals in a Wide Range of Sizes Using Orthogonal Methods. American Pharmaceutical Review, 2019. americanpharmaceuticalreview.com
Carpenter JF, Randolph TW, Jiskoot W, Crommelin DJ, Middaugh CR, Winter G. Potential inaccurate quantitation and sizing of protein aggregates by size exclusion chromatography: essential need to use orthogonal methods to assure the quality of therapeutic protein products. J Pharm Sci. 2010;99(5):2200–2208. doi:10.1002/jps.21989
den Engelsman J, Garidel P, Smulders R, et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm Res. 2011;28(4):920–933. doi:10.1007/s11095-010-0297-1
Национальный институт контроля пищевых продуктов и лекарственных средств КНР (NIFDC). Создание и валидация метода аналитического ультрацентрифугирования в режиме седиментационной скорости для определения вариантов моноклональных антител по размеру (на кит. языке). (Полные библиографические данные обновляются.)
Schuck P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biophys J. 2000;78(3):1606–1619. doi:10.1016/S0006-3495(00)76713-0
Uchiyama S, Noda M, Krayukhina E. Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation for characterization of therapeutic antibodies. Biophys Rev. 2018;10(2):259–269. doi:10.1007/s12551-017-0374-3
Best Practices for Aggregate Quantitation of Antibody Therapeutics by Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation. J Pharm Sci. 2022;111(7):2121–2133. doi:10.1016/j.xphs.2021.12.023
Berkowitz SA. Role of analytical ultracentrifugation in assessing the aggregation of protein biopharmaceuticals. AAPS J. 2006;8(3):E590–E605. doi:10.1208/aapsj080368