Количественная оценка зарядовой гетерогенности методом капиллярного изоэлектрического фокусирования: границы калибровки pI, полноты фокусирования и расчёта по площади пиков

1 Введение

Зарядовую гетерогенность обычно охватывают двумя методами: катионообменной хроматографией (CEX) и капиллярным изоэлектрическим фокусированием (cIEF / icIEF). В регистрационных досье часто пишут: «зарядовые варианты определены двумя методами, результаты согласуются». С методологической точки зрения это утверждение проблематично: два метода измеряют не одно и то же.

CEX разделяет по силе электростатического взаимодействия белка с отрицательно заряженной неподвижной фазой, а результатом является время удерживания. Оно зависит от серии колонки, крутизны солевого градиента, pH и температуры колонки; изменение любого из них сдвигает пики. Поэтому «доля кислых пиков» в CEX — относительная величина, справедливая только в рамках конкретной системы разделения, и межлабораторное сравнение требует сначала проверки пригодности системы.

icIEF разделяет по точке, в которой собственный суммарный заряд белка равен нулю, и выдаёт pI. pI определяется главным образом первичной структурой и посттрансляционными модификациями молекулы, поэтому при контролируемых условиях метода она удобна для сравнения серий. Но сообщаемое значение — кажущаяся pI, откалиброванная по маркерам, и между платформами, комбинациями амфолитов и маркеров возможны систематические различия; сравнение между приборами и лабораториями предполагает определённые условия метода и пригодность системы. В этом ценность icIEF и причина её большого веса при выпуске серий и в исследованиях сопоставимости.

Однако в этой цепочке есть четыре звена, которые не подают сигнала тревоги:

pI вычисляется, а не считывается. Прибор регистрирует положение пика в окне детекции в пикселях; pI получают пересчётом через регрессию маркеров. Если маркеры подобраны неудачно, охватывают слишком узкий диапазон или регрессия плохая, pI недостоверен — а программа об этом не предупредит.

Нет объективного признака завершения фокусирования. При подаче напряжения ток падает, но «до какого уровня он должен упасть» — вопрос суждения. И недостаточное, и избыточное фокусирование дают читаемые пики, и оба могут дать неверный pI или уширенные пики.

Знаменатель нормировки никто не проверяет. Нормировка по площади требует, чтобы знаменатель был «суммой площадей всех белковых пиков». Если в него включены системные пики, пики маркеров или артефакты базовой линии, знаменатель растёт, и все процентные значения пропорционально занижаются.

Длина волны детекции скрывает допущение. icIEF детектирует при 280 нм, а молярные коэффициенты поглощения зарядовых вариантов не строго равны; нормировка неявно предполагает «равные факторы отклика».

В статье эти четыре звена разобраны по отдельности: для каждого приведены основания для суждения и требования к отчёту.

2 Принципы

2.1 Фокусирование: формирование градиента pH и самопозиционирование белка

Капилляр заполняют амфолитами-носителями, а его концы погружают в кислый анолит и щелочной католит. При подаче напряжения амфолиты выстраиваются вдоль капилляра по своим pI и образуют градиент pH, непрерывно возрастающий от анода к катоду.

Попав в этот градиент, белок в области pH кислее своего pI заряжен положительно и движется к катоду; в более щелочной области он заряжен отрицательно и движется к аноду. Оба движения толкают его к точке нулевого суммарного заряда, где миграция прекращается. Диффузия и фокусирование приходят в равновесие, и белок образует узкую зону.

Из механизма самопозиционирования следуют три прямых вывода:

• pI — это информация о положении, а не об интенсивности. Высота пика воспроизводится гораздо хуже, чем его положение: высота зависит от нагрузки, адсорбции и линейности детектора, а положение — только от градиента.
• Фокусировка — динамическое равновесие, а не статичное осаждение. Ширина полосы определяется конкуренцией фокусировки (сужение) и диффузии (уширение), поэтому существует подходящий диапазон времени фокусировки; за его пределами полоса может снова расширяться, например из-за тепловых эффектов или дрейфа градиента.
• Градиент создают амфолиты, поэтому его линейность ограничена. Коммерческие амфолиты дают более крутой градиент на краях шкалы pH (<3 и >10), где разрешение падает. В этом физическая причина худшего извлечения и разрешения белков с экстремальным pI.

2.2 pI — результат регрессии: маркеры, пиксели и линейность

Общая статья 3129 ChP чётко задаёт расчёт pI: строят линейную регрессию pI каждого маркера изоэлектрической точки по его положению в пикселях и подставляют положение каждого зарядового варианта в уравнение регрессии, получая его pI.

Эта фраза содержит три ограничения, и каждое может нарушиться:

Маркеры должны охватывать целевое значение. Если целевой pI лежит между наибольшим и наименьшим маркерами — это интерполяция; за их пределами — экстраполяция. Неопределённость экстраполяции быстро растёт с расстоянием и не отражается в R² регрессии: R² показывает лишь, что сами маркеры хорошо ложатся на прямую, а не то, что экстраполированный диапазон надёжен.

Значения pI маркеров номинальны. У маркеров есть собственная неопределённость (обычно порядка ±0,05 pH), которая переносится систематическим смещением на все результаты. При сравнении серий с маркерами разных производителей систематическое смещение pI может достигать 0,05–0,1 pH — этого достаточно, чтобы скрыть небольшой реальный сдвиг.

Линейность «пиксель → pH» соблюдается только в линейной части градиента. На краях градиент может отклоняться от линейности, а линейная регрессия усредняет такой изгиб. Остатки маркеров, положительные на краях и отрицательные в середине, указывают на возможный систематический изгиб; действительно ли он вызван увеличением крутизны на краях, нужно подтвердить дополнительными маркерами или независимыми данными. До этого лучше сузить рабочий диапазон, а не продолжать пользоваться всей линией регрессии.

2.3 Разрешающая способность: 0,02 pH — типичное значение в определённых условиях

Общая статья ChP 0542 указывает, что гели с амфолитами-носителями обычно позволяют разделять белки с разницей pI около 0,02 единицы pH, а иммобилизованные градиенты pH дополнительно повышают разрешение. Это типичная способность в определённых условиях гелевой ИЭФ.

Эта величина полезна как опорная точка для суждения, а не как фиксированная граница для любого капиллярного метода и образца. Реальную разрешающую способность следует определять по данным для конкретного образца и метода. Она подсказывает, что:

• чем ближе ΔpI соседних пиков к реальной разрешающей способности метода, тем меньше помогает повышение напряжения или удлинение фокусировки — часто оба пика просто вместе расширяются;
• когда в отчёте сказано «обнаружено пять кислых вариантов», первым вопросом должны быть не параметры интегрирования, а то, превышает ли каждая соседняя ΔpI разрешающую способность, подтверждённую для этого метода;
• при сочетании нескольких модификаций и очень малой ΔpI соседних компонентов пик может выглядеть уширенным, а не раздвоенным — такую форму легко неверно истолковать. Можно ли их разрешить, следует судить по данным о разрешении, полученным при разработке метода, а не выводить из типа модификации.

2.4 Допущение о факторе отклика при детекции на 280 нм

icIEF детектирует белки при 280 нм. Статья сообщает относительные площади пиков в заданных условиях детекции; считать относительные площади молярными долями можно, только если у всех пиков одинаковый молярный коэффициент поглощения.

Для зарядовых вариантов интактного IgG допущение выполняется приблизительно: дезамидирование, остаточный C-концевой лизин и концевое сиалирование N-гликанов затрагивают лишь несколько остатков или сахаров, и их влияние на поглощение при 280 нм обычно составляет несколько процентов — меньше неопределённости самого интегрирования.

Но в ряде ситуаций допущение явно нарушается:

• Образцы с фрагментами. Fab и Fc сильно различаются по составу ароматических остатков, а значит, и по молярному коэффициенту поглощения; если интактные молекулы и фрагменты присутствуют вместе, отношения площадей систематически отклоняются от мольных.
• Образцы с заметно различающимися гликоформами. Гликаны не поглощают при 280 нм. Различия молярной массы, вызванные гликоформами, влияют главным образом на пересчёт молярных долей в массовые; само по себе различие молярной массы не означает изменения молярного отклика при 280 нм.
• Агрегаты. Отклик агрегатов при 280 нм искажается светорассеянием, поэтому их кажущееся поглощение завышено.

Поэтому допущение «относительная площадь пика равна молярной доле» следует указывать в ограничениях метода, а не принимать по умолчанию.

3 Экспериментальная часть

3.1 Условия метода 1 общей статьи 3129 ChP

Общая статья 3129 тома IV ChP 2025 устанавливает, что зарядовые варианты моноклональных антител определяют методом визуализирующего капиллярного изоэлектрического фокусирования всей колонки (icIEF, метод 1) или капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF, метод 2). Варианты разделяют по изоэлектрической точке в соответствии со статьёй о капиллярном электрофорезе (общая статья 0542), определяют pI и рассчитывают процентное содержание. Элементы метода 1:

Две детали заслуживают отдельного комментария.

Метилцеллюлоза — не вспомогательное вещество, а подавитель потока. Она повышает вязкость и подавляет электроосмотический поток и конвекцию, чтобы узкие зоны, образованные фокусированием, не размывались движением жидкости. Неправильное приготовление (неполное растворение, ошибка концентрации) проявляется уширением пиков без обязательного сдвига pI — это похоже на недостаточное фокусирование, и легко поставить неверный диагноз.

Отсек для образцов (4–10 °C) и капилляр (18–25 °C) — две разные точки термостатирования. Первая предотвращает деградацию или агрегацию образцов в ожидании ввода; вторая задаёт электропроводность и вязкость при фокусировании. Понизить температуру отсека, чтобы «защитить образец», разумно, но если при этом понизить и температуру капилляра, кинетика фокусирования изменится и время фокусирования придётся подтверждать заново.

3.2 Обессоливание: обязательный шаг, а не опция

Статья 3129 прямо указывает: образцы с высокой концентрацией солей перед анализом необходимо обессоливать.

Причина — электропроводность. При фокусировании ток в капилляре переносят и амфолиты-носители, и ионы образца. Если образец вносит много соли:

1. при фиксированных напряжении и длине капилляра средняя напряжённость поля задаётся напряжением и длиной; но высокая концентрация соли повышает проводимость и ток, меняет локальное распределение поля, тепловую нагрузку и формирование градиента, так что фокусировка может не завершиться за отведённое время;
2. рост тока увеличивает джоулев нагрев; в нагретой зоне падает вязкость, усиливается диффузия, полосы расширяются;
3. ионы соли перераспределяются в градиенте, локальный pH нарушается, и показания pI смещаются.

В сумме это выглядит как «уширенные пики, немного смещённый pI, плохая воспроизводимость». Такие проблемы часто списывают на «грязный капилляр» или «различия между сериями», хотя на деле это матричный эффект.

Цель обессоливания — не удалить всю соль, а снизить проводимость до уровня, допустимого для методики. Этот уровень следует определить при разработке методики в опыте с добавкой соли: вносить в один и тот же образец возрастающие концентрации NaCl, отметить, когда pI и ширина пика начинают отклоняться, и записать эту концентрацию в СОП как предел солеустойчивости методики.

3.3 Последовательность и проверка пригодности системы

Статья 3129 задаёт порядок ввода: раствор для проверки пригодности системы, холостой раствор, стандартный образец, затем испытуемые образцы. Раствор для проверки пригодности вводят не менее двух раз в начале последовательности и не менее одного раза в конце; холостой раствор и стандартный образец — по одному разу.

Замысел здесь трёхчастный:

• Не менее двух вводов в начале позволяют отделить эффект первого ввода от реальных результатов. Первый ввод часто даёт аномальную форму пика, потому что стенка капилляра ещё не уравновешена; разница между двумя вводами сама по себе полезная информация.
• Не менее одного ввода в конце позволяет уловить дрейф. Если конечный результат заметно отличается от начального, пересмотру подлежат данные всей последовательности, а не только последние образцы.
• Холостой раствор идёт после проверки пригодности и перед стандартным образцом, чтобы сначала убедиться в чистоте области интегрирования. Статья требует, чтобы в холостом растворе были обнаружены оба маркера изоэлектрической точки, а область интегрирования образца между пиками маркеров была свободна от отрицательных пиков, выбросов и других небелковых пиков, мешающих интегрированию. Это напрямую связано со знаменателем, рассмотренным в §4.2.

3.4 Выбор между методом 1 и методом 2

Метод 1 (icIEF) визуализирует всю колонку и за одну экспозицию фиксирует распределение pI по всему капилляру без стадии миграции, поэтому в нём нет источника ошибки «дрейф времени миграции», и повторяемость обычно лучше, чем у метода 2. Метод 2 (cIEF) сканирует точку за точкой через единственное окно детекции: после фокусирования химическая или гидродинамическая мобилизация проталкивает градиент через окно, и мобилизация вносит дополнительное уширение пиков.

В лабораториях без прибора icIEF метод 2 остаётся рабочим вариантом, но в методике нужно дополнительно подтвердить влияние условий мобилизации (давления или концентрации химического мобилизатора) на показание pI и учесть это влияние в неопределённости методики.

4 Обработка данных и интегрирование

4.1 Четыре записи для регрессии pI

Достоверность pI определяется регрессией, поэтому фиксировать нужно качество регрессии, а не только итоговое число. Методика должна всегда регистрировать четыре позиции:

Картина остатков — самый часто упускаемый и самый диагностически ценный из четырёх пунктов. R² нечувствителен к систематическому изгибу: пять точек, выгнутых дугой, всё ещё дают R² = 0,999. Распределение знаков остатков может указать на изгиб; вызван ли он нелинейностью градиента или самими маркерами, нужно решать с привлечением дополнительных маркеров или независимых данных.

4.2 Знаменатель нормировки: какие пики считаются белковыми

Статья 3129 рассчитывает процентное содержание нормировкой по площади пиков: площадь каждого зарядового варианта в процентах от суммы площадей всех белковых пиков.

Всё зависит от определения «белкового пика». На электрофореграмме дают пики четыре вида веществ, но природа у них разная:

• Зарядовые варианты образца: включаются в знаменатель.
• Маркеры изоэлектрической точки: не включаются. Это добавленные внутренние стандарты; их положение используют для регрессии, а площадь никак не связана с содержанием образца.
• Системные пики: дают амфолиты, метилцеллюлоза или покрытие капилляра; не включаются. Требование отсутствия мешающих пиков в области интегрирования на холостой электрофореграмме существует именно для их исключения.
• Артефакты базовой линии: вызваны пузырьками, частицами или шумом детектора, выглядят как очень узкие выбросы или перевёрнутые пики; не включаются.

Последствие загрязнённого знаменателя однонаправленно: лишний учтённый пик пропорционально занижает все проценты и систематически разбавляет чистоту основного пика. Такое смещение может ускользнуть от показателей, контролирующих только pI и процент основного пика; требования статьи к мешающим пикам в холостой пробе и к сходству электрофореграмм существуют именно для процедурной защиты от него.

4.3 Граница между кислыми, основным и щелочными пиками

Границы трёх областей должны быть заранее заданы методикой, а не определяться программой интегрирования по форме пиков. Обычная практика — граница по pI основного пика: варианты с меньшим pI считаются кислыми, с большим — щелочными.

У этого определения есть неявная предпосылка: основной пик сам является «немодифицированной» формой. Если большая часть образца уже модифицирована (например, сильно дезамидированный образец), основной пик может уже не соответствовать теоретическому pI. Тогда смысл «кислый/щелочной» нужно пересмотреть, а в отчёте приводить pI и долю каждого пика, а не единственную «долю кислых пиков».

Точки разделения также следует фиксировать с точностью до двух знаков после запятой и вписывать в методику. Сдвиг точки разделения на 0,05 pH может изменить долю кислых пиков на несколько процентных пунктов — и это изменение никак не связано с образцом.

4.4 Оценка полноты фокусировки: несколько показателей вместе

Главное в этом разделе: время фокусировки нельзя копировать, его нужно подтверждать для каждого образца. Столь широкий диапазон, как 4,5–15 мин в статье, показывает, что конечную точку нужно устанавливать для конкретного образца и метода.

Показатели, которые стоит наблюдать совместно при разработке метода:

Выход тока на плато. По мере формирования градиента и фокусировки амфолитов проводимость в капилляре падает, а с ней и ток. Когда ток приближается к стабильному значению (изменение между соседними отсчётами ниже заданного порога), фокусировка близка к завершению; остановка при всё ещё заметно падающем токе может означать недофокусировку.

Ширина основного пика, кажущаяся pI и разрешение ключевых пиков. Регистрируйте, как полуширина основного пика, его кажущаяся pI и разрешение ключевых соседних пиков меняются со временем фокусировки. Конечную точку следует выбирать там, где все три стабильны. Если ширина снова растёт, проверьте дрейф pI, ток и матрицу образца, а не приписывайте это сразу одному механизму.

Ни одного показателя в отдельности недостаточно: один ток пропускает случаи, когда ширина или pI ещё меняются; одна ширина пика пропускает случаи, когда ток ещё высок и матрица не уравновесилась.

4.5 Что обязательно должно быть в отчёте

Отчёт icIEF, пригодный для регистрационного досье, помимо результатов должен содержать:

1. перечень маркеров с номинальным pI и серией каждого;
2. уравнение регрессии и положение целевого pI относительно диапазона маркеров (интерполяция / экстраполяция);
3. границы области интегрирования (заданные положениями пиков маркеров);
4. pI, разделяющий кислые, основной и щелочные пики, и обоснование этого значения;
5. pI и долю основного пика с SD / RSD для трёх вводов проверки пригодности системы;
6. холостую электрофореграмму (подтверждение чистоты знаменателя);
7. допущение о равенстве факторов отклика и заключение о его применимости.

Из семи пунктов чаще всего в существующих отчётах отсутствуют пункты 2, 6 и 7 — и именно они сильнее всего влияют на достоверность выводов.

5 Результаты и обсуждение

5.1 icIEF и CEX: один образец, два вида «кислого»

Рассмотрим гипотетический пример (значения построены, не измерены): пусть образец рекомбинантного IgG1 даёт 43,4% кислых пиков по icIEF, а по CEX — 27,0% кислых, 61,7% основного и 11,3% щелочных.

Два кислых значения различаются на 16,4 процентного пункта. Это не обязательно означает, что один из методов ошибается; одно из возможных объяснений — «кислый» означает в каждом методе разное:

• В icIEF «кислый» — критерий по pI: кислым считается всё, что имеет pI ниже основного пика, включая дезамидирование, сиалирование, потерю C-концевого лизина и любые другие модификации, снижающие pI.
• В CEX «кислый» — критерий по удерживанию: кислым считается всё, что элюируется раньше основного пика, в зависимости от того, даёт ли модификация достаточную разницу удерживания при данном градиенте.

Некоторые модификации могут заметно менять pI, но почти не менять удерживание в CEX (например, модификации с малым изменением суммарного заряда, в основном перераспределяющие поверхностный заряд); другие могут хорошо разделяться в CEX, но различаться по ΔpI меньше реальной разрешающей способности метода icIEF. Эти множества не вложены друг в друга, а лишь частично пересекаются.

Отсюда два правила интерпретации:

Никогда не пересчитывайте значения друг в друга; используйте их лишь для подтверждения тенденций. Если у серии растут кислые пики icIEF, а кислые пики CEX не меняются, не делайте сразу вывод о «расхождении методов»; сначала подумайте, не относится ли модификация к типу «меняет pI, но не удерживание». Рост в обоих методах усиливает суждение о тенденции, но подтверждение идентичности или общего количества вариантов всё равно требует других доказательств (например, сбора фракций и масс-спектрометрии).

В регистрационном досье указывайте результаты раздельно, не объединяя их. Формулировка «результаты двух методов согласуются» скрывает информацию; точнее привести оба результата и пояснить, что методы по-разному определяют «кислый». При ссылке на измеренные данные укажите источник образца, условия обоих методов, исходные электрофореграммы и хроматограммы и правила интегрирования.

5.2 Перенос метода: числовые критерии, сходство с эталонной электрофореграммой и заранее установленные критерии переноса в совокупности

Статья 3129 прямо указывает: если приборы icIEF разных производителей или капилляры различаются по производителю или спецификации, электрофореграмма стандарта для проверки пригодности может несколько отличаться формой пиков от эталонной.

Это разрешает постоянно возникающий при переносе методики спор: если электрофореграмма принимающей лаборатории не совпадает полностью с электрофореграммой передающей, можно ли признать перенос успешным?

Ответ: небольшие различия формы пиков сами по себе не основание для отказа, но и игнорировать электрофореграмму, опираясь только на числа, нельзя. Требования статьи к пригодности системы охватывают и числовые критерии, и сходство с эталонной электрофореграммой, и допускают небольшие различия формы пиков из-за разных приборов или капилляров. Перенос следует оценивать по совокупности:

• значения пригодности системы: находятся ли pI и процент основного пика, а также их SD / RSD в установленных пределах;
• сходство с эталонной электрофореграммой: совпадают ли число, относительное положение и распределение пиков, а различия ограничиваются небольшими изменениями формы;
• заранее установленные критерии переноса: выполнены ли показатели сравнения и пределы приемлемости, заранее согласованные в протоколе переноса.

Так метод не отвергается из-за неизбежных различий формы пиков между производителями, а перенос метода не сводится ни к чистому сравнению чисел, ни к сравнению картинок.

5.3 Три ловушки

Ловушка 1: экстраполяция pI. Когда целевой pI лежит за пределами диапазона маркеров, программа всё равно выдаёт pI без предупреждения. Как распознать: сверить целевой pI с перечнем маркеров. Что делать: перейти на набор маркеров с подходящим охватом или пометить в отчёте значение как экстраполированное и указать расстояние экстраполяции.

Ловушка 2: приписывать уширение пиков одной причине. Недофокусировка, тепловые эффекты и влияние матрицы (соли) могут проявляться одинаково — «пики шире, воспроизводимость хуже», — но требуют разных действий. Как распознать: смотрите вместе на кривую «ток–время», на то, дрейфует ли ещё кажущаяся pI основного пика, и на разрешение ключевых пиков. Ток, который ещё заметно падает, указывает на недофокусировку; если ток стабилен, а ширина и pI продолжают меняться, проверьте тепловую нагрузку, матрицу и стабильность градиента. Основывайте меры на доказательствах — ошибочный диагноз ухудшает результат с каждой настройкой.

Ловушка 3: загрязнённый знаменатель. Если системные пики холостой электрофореграммы попадают в область интегрирования и не исключены, знаменатель раздувается, и все процентные значения занижаются. Как распознать: просматривать холостую электрофореграмму в каждой последовательности, а не один раз при разработке методики. Что делать: скорректировать границы интегрирования или сменить серию амфолитов.

5.4 Ограничения

• Разрешение ограничено линейностью градиента. В области экстремальных pI (<3 или >10) градиент крутой, разрешение низкое; варианты в этой области можно охарактеризовать только качественно.
• Гидрофобные и мембранные белки плохо извлекаются. Адсорбция на стенке капилляра при фокусировании снижает извлечение, что видно по заниженной суммарной площади, при этом соотношение пиков может оставаться верным.
• Метод не определяет тип модификации. icIEF группирует формы только по pI, и в одной точке pI могут накладываться несколько модификаций. Для их идентификации нужны пептидное картирование, анализ гликанов или сбор фракций CEX.
• Допущение о факторе отклика (см. §2.4) может не выполняться для образцов с фрагментами.

6 Сравнение фармакопей

* Перед цитированием сверьте номера и действующий статус статей USP и EP с последними официальными изданиями.

7 Выводы

1. pI — результат регрессии, а не прямое показание. Его достоверность определяется охватом маркеров и картиной остатков регрессии, а не одним R². Целевой pI внутри диапазона маркеров интерполирован, за его пределами — экстраполирован, и в одном отчёте эти значения не должны иметь одинаковый вес.
2. Полнота фокусировки — это состояние, а не время. Устанавливайте конечную точку при разработке метода, наблюдая совместно выход тока на плато, ширину основного пика, стабильность кажущейся pI и разрешение ключевых пиков. 4,5–15 мин в статье — это диапазон, а не рекомендуемое значение.
3. Процентное содержание зависит от того, что учтено. Состав знаменателя определяется границами интегрирования и чистотой холостой пробы; загрязнённый знаменатель даёт однонаправленное смещение, которое может ускользнуть от показателей, контролирующих только основной пик, и его нужно предотвращать процедурно.
4. «Кислые» в icIEF и в CEX — не одно и то же множество. Значения двух методов нельзя калибровать друг по другу, можно лишь взаимно подтверждать тенденции; в досье их следует приводить раздельно с пояснением различий в определении.
5. Перенос метода оценивайте по совокупности данных. Сочетайте значения пригодности системы, сходство с эталонной электрофореграммой и заранее установленные критерии переноса; статья допускает небольшие различия формы пиков между приборами или капиллярами, но это не значит, что электрофореграмму можно игнорировать.
6. Относительные площади пиков предполагают одинаковый молярный отклик при 280 нм — приблизительно верно для зарядовых вариантов интактного IgG; образцы с фрагментами требуют отдельного подтверждения с указанием в ограничениях. Различия гликоформ влияют главным образом на пересчёт между молярными и массовыми долями.

Литература