Nota de aplicación

AUC frente a SEC: ¿el 1 % de su informe es realmente el 1 % de su muestra?

28 de septiembre de 2026 · Lectura aproximada: 8 min

La SEC es el método fundamental para el análisis de agregados, pero solo detecta la fracción de la muestra que atraviesa la columna sin alteraciones. La ultracentrifugación analítica (AUC) no utiliza columna ni patrones y separa las moléculas a partir de principios físicos fundamentales en su propio tampón de formulación. Precisamente por ello, los organismos reguladores y la industria la emplean como comprobación ortogonal de la SEC.

1. Cuando la SEC indica que «no hay problema», puede que sí lo haya

La SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) es el método rutinario para el análisis de agregados: rápido, de alto rendimiento y reproducible, con sensibilidad para agregados hasta el nivel del 0,1 %; constituye el pilar del desarrollo y el control de calidad^[4]. Sin embargo, sus resultados presentan intrínsecamente cuatro sesgos:

Cuatro sesgos ocultos en el funcionamiento rutinario

Dilución: La dilución antes de la columna y dentro de ella puede disociar dímeros asociados de forma reversible^[9].
Fase móvil: Para obtener buenos perfiles de picos, la SEC suele utilizar fases móviles de elevada fuerza iónica, diferentes de la formulación, lo que desplaza la distribución de las especies^[4],[9].
Interacción con la fase estacionaria: Las interacciones inespecíficas entre la muestra y la resina pueden tanto inducir nueva agregación como retener en la columna agregados preexistentes^[5],[9].
Intervalo de separación: Las columnas de SEC convencionales cubren un intervalo de tamaños limitado.

El último sesgo tiene un límite estricto: la SEC es esencialmente una etapa de filtración y los agregados de tamaño superior a unos 40–60 nm normalmente no pueden atravesar el lecho de la columna^[4],[5]. Un «1 % en el informe de SEC» no significa un «1 % en la muestra»; puede describir únicamente la fracción que la columna dejó pasar. Por tanto, los resultados de SEC deben contrastarse siempre con la recuperación de la muestra^[4].

Terminología　Lo que la SEC «detecta» está limitado por el intervalo de separación del lecho de la columna; los agregados que superan el límite superior de tamaño de poro se filtran antes de llegar al detector, de modo que «no detectado» ≠ «no presente».

Figura 1. Ningún método por sí solo cubre todo el intervalo de tamaños. La SEC solo detecta la fracción que la columna deja pasar; la SV-AUC no tiene lecho de columna y capta los agregados nanométricos dentro de la misma distribución (el segmento más claro señala las especies de mayor tamaño que requieren un ajuste de la velocidad del rotor). Esquema; las clases de tamaño siguen la clasificación de Narhi et al. y las referencias [4] y [9]; los límites de los métodos son valores habituales.

La ortogonalidad no es burocracia: es física

La guía de la FDA estadounidense sobre la evaluación de la inmunogenicidad de productos de proteínas terapéuticas recomienda métodos que, individualmente o en combinación, mejoren la detección de agregados^[1]; la directriz ICH Q6B incluye el peso molecular, el tamaño y los agregados entre las propiedades fisicoquímicas y exige su separación y cuantificación^[2]; la Farmacopea china de 2020 (volumen III, capítulo general sobre anticuerpos monoclonales recombinantes de uso humano) también incluye las variantes de tamaño como ensayo obligatorio^[3].

El consenso del sector: la cuantificación de agregados debe clasificarse por tamaño y basarse en al menos dos métodos ortogonales, porque no existe un patrón de referencia de agregados y cualquier método individual solo cubre una ventana de tamaños limitada; la concentración en cada ventana debe verificarse mediante un método basado en un principio de medición diferente^[4],[6].

También existe un precedente metodológico publicado: los National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC, China) han publicado el desarrollo y la validación de un método de SV-AUC para variantes de tamaño de anticuerpos monoclonales, con optimización de la velocidad del rotor, la temperatura y los parámetros de procesamiento de datos, y un examen sistemático de la especificidad, la repetibilidad, la precisión y la linealidad^[7]. Los datos completos de validación del método están disponibles previa solicitud.

2. AUC: una carrera sin pista

La física de la AUC es mínima: se aplica un campo centrífugo, se observa en tiempo real la redistribución espacial de las macromoléculas y se analizan cuantitativamente los datos a partir de principios fundamentales. Sin marcado, sin modificación química y sin contacto con ninguna matriz o fase estacionaria, lo que la hace excepcionalmente suave para sistemas sensibles a las perturbaciones^[9],[11].

Figura 2. Ultracentrifugación analítica: separación en solución sin columna ni marcadores. El sistema óptico escanea repetidamente la celda durante la centrifugación y registra la concentración en función del radio y del tiempo; las especies se separan de forma natural según su coeficiente de sedimentación (una función de la masa, la forma y la densidad). Esquema no a escala.

Dos modalidades: a qué velocidad sedimenta o dónde se estabiliza

La velocidad de sedimentación (SV-AUC) sigue el límite móvil a alta velocidad del rotor y obtiene una distribución continua de coeficientes de sedimentación c(s) mediante el ajuste directo de la ecuación de Lamm^[8], resolviendo las especies según su valor de s: es tanto un perfil de composición como una fuente de información de baja resolución sobre la forma (relación de fricción). El equilibrio de sedimentación (SE-AUC) espera a menor velocidad hasta que la sedimentación y la difusión se equilibran, lo que permite obtener directamente el peso molecular absoluto y la constante de asociación K_D a partir del perfil de concentración en equilibrio^[9],[11].

Dimensión	Velocidad de sedimentación (SV-AUC)	Equilibrio de sedimentación (SE-AUC)
Configuración	Alta velocidad; seguimiento del proceso de sedimentación	Menor velocidad; espera de la distribución en equilibrio
Observable	Movimiento del límite de sedimentación a lo largo del tiempo	Distribución de concentración en equilibrio
Resultado principal	Distribución de coeficientes de sedimentación, fracciones de especies	Peso molecular absoluto, constantes de unión, estequiometría
Respuestas más adecuadas	Qué contiene la muestra y en qué proporción cada componente	Cuál es el peso molecular y qué intensidad tiene la unión
Aplicaciones habituales	Cuantificación de agregados, estado oligomérico, comprobación ortogonal de la SEC	Confirmación del peso molecular, termodinámica de interacciones

Tabla 1 | Las dos modalidades son independientes tanto en el diseño como en el análisis: determine primero si necesita una «distribución» o una «afinidad» y después elija la modalidad.

Piénselo así: la SV pone juntos en el agua a nadadores de distinta complexión y observa quién se hunde más rápido; la SE espera hasta que todos dejan de moverse y lee la profundidad a la que flota cada uno. Una mide la velocidad de sedimentación y la otra, la posición final de reposo.

Figura 3. Formas de los datos brutos de las dos modalidades. A: en la SV, el límite se desplaza hacia el fondo de la celda con el tiempo; su velocidad proporciona el coeficiente de sedimentación y su ensanchamiento, la difusión; el ajuste de c(s) convierte estos datos en una distribución de especies. B: en la SE, la sedimentación y la difusión alcanzan el equilibrio y la concentración aumenta exponencialmente a lo largo del radio; la forma depende únicamente del peso molecular y de las interacciones, no de la forma molecular.

3. Parámetros, casos de uso y tres conceptos erróneos habituales

Parámetros reutilizables (respaldados por una validación de método publicada)

Parámetro	Valor	Fundamento
Velocidad del rotor	50.000 rpm	Velocidad procedente de la optimización del método [7]
Temperatura	20 °C	Temperatura procedente de la optimización del método [7]
Óptica / longitud de onda	UV / 280 nm	La adquisición a múltiples longitudes de onda puede separar las señales de proteínas y ácidos nucleicos [7]
Resolución de la cuadrícula c(s)	150	Resolución = 150 [7]
Intervalo de valores de s	0,1 – 20 S	Límite superior s_max = 20 S [7]

Tabla 2 | Parámetros de un método de SV-AUC publicado y validado [7]; punto de partida de referencia para métodos similares. Las formulaciones con azúcares o polioles y las muestras de alta concentración requieren una evaluación independiente [9], [10].

Estas condiciones se respaldan en un paquete completo de validación: repetibilidad con un RSD del 0,91 % en 6 ejecuciones, precisión global con un RSD del 0,78 % y buena linealidad en el intervalo de 0,2–0,8 mg/mL^[7].

La SV-AUC proporciona datos de especificidad, repetibilidad, precisión y linealidad: no es una herramienta de investigación limitada a «observar», sino un método analítico que puede incluirse en los expedientes regulatorios y superar el examen de la revisión; las mejores prácticas publicadas ya estructuran la validación de la SV-AUC dentro del marco ICH Q2^[10].

Figura 4. Distribución c(s) por SV-AUC de una muestra de anticuerpo monoclonal (ilustrativa). Una única ejecución registra fragmentos, monómeros, dímeros y agregados de orden superior en un mismo eje; la integración de cada pico proporciona su fracción relativa y los picos minoritarios requieren pruebas de significación (p. ej., estadística F) [9].

Preguntas que puede plantear a la AUC

Preguntas para la toma de decisiones: Verificación de la fiabilidad de los resultados de SEC; confirmación del estado oligomérico y la estequiometría; interacciones y constantes de unión K_D; evaluación de la propensión a la agregación durante el cribado de formulaciones; datos ortogonales para la consistencia de liberación, los cambios y la comparabilidad con el producto original.
Tipos de muestras: Anticuerpos monoclonales / biespecíficos / fusiones Fc; péptidos (agonistas del receptor de GLP-1); vectores virales (AAV / VLP: la óptica de múltiples longitudes de onda resuelve cápsides vacías, parciales y llenas y estima el contenido de ácido nucleico); ADC; proteínas no anticuerpo como el colágeno.

Tipo de muestra	Preguntas que responde
Anticuerpo monoclonal / biespecífico / fusión Fc	Agregados, fragmentos, consistencia entre lotes, cribado de tampones de formulación, verificación de resultados de SEC
Péptidos (agonistas del receptor de GLP-1)	Heterogeneidad de pureza, evaluación de la propensión a la agregación, validación de métodos para registros en EE. UU.
Vectores virales (AAV / VLP)	Resolución a múltiples longitudes de onda de partículas vacías / parciales / llenas con estimación del contenido de ácido nucleico; control de agregados
ADC	Variantes de tamaño y comportamiento de agregación tras la conjugación de cargas hidrofóbicas; confirmación ortogonal de atributos relacionados con la conjugación
Colágeno y otras proteínas no anticuerpo	Análisis de agregados y estados de ensamblaje en condiciones casi nativas
Interacciones de proteínas / complejos de ácidos nucleicos	Relaciones antígeno–anticuerpo, K_D de ligando–receptor, complejos proteína–ácido nucleico

Tabla 3 | La lista de escenarios resume nuestro ámbito de servicios; la idoneidad para una muestra concreta requiere una evaluación del método.

Tres conceptos erróneos habituales

Concepto erróneo 1: «La SEC ya ha medido los agregados; la AUC es un trabajo duplicado».

Los mecanismos de separación y el estado físico de la muestra son completamente diferentes: la AUC no tiene fase estacionaria, mide en el tampón de formulación y detecta especies que no pueden atravesar la columna de SEC. La AUC es una comprobación cruzada de la SEC, no una repetición^[1],[9],[10].

Concepto erróneo 2: «La AUC solo sirve para determinar el peso molecular».

La SV se centra en las distribuciones de especies; la SE, en el peso molecular y los parámetros termodinámicos: son diseños experimentales y rutas de datos totalmente diferentes^[11].

Concepto erróneo 3: «Si los dos métodos no coinciden, el experimento se hizo mal».

Todo lo contrario: la discrepancia en sí misma es lo importante. Especialmente en muestras sometidas a estrés por calor, agitación o sacudidas, la SEC y la SV-AUC discrepan con frecuencia, lo que señala especies que el análisis de SEC no logró recuperar: una pista diagnóstica que debe investigarse^[4],[9].

4. Servicios analíticos de Quickgene: oferta y entregables de AUC

Nuestra plataforma de ultracentrifugación analítica abarca el desarrollo de métodos, la validación completa de métodos, los ensayos rutinarios y el ajuste de datos; cada etapa ya se ha aplicado en proyectos regulatorios. Entre los trabajos representativos se incluyen:

Registro de productos peptídicos en EE. UU.: Validación completa de métodos de SV-AUC para semaglutida, tirzepatida y otros (especificidad, precisión, exactitud, límite de cuantificación, linealidad e intervalo, robustez);
Ensayos de liberación de AAV: Discriminación y cuantificación de cápsides vacías / parciales / llenas y control de agregados, con entrega de la validación completa del método;
Solicitudes BLA de medicamentos de anticuerpos: Desarrollo y validación de métodos de SV-AUC para variantes de tamaño en apoyo de los expedientes de solicitud;
Caracterización de ADC: Evaluación de variantes de tamaño y agregación tras la conjugación de cargas hidrofóbicas, con confirmación ortogonal de atributos relacionados con la conjugación junto con LC-MS;
Colágeno y otras proteínas recombinantes: Análisis de agregados y estados de ensamblaje en condiciones casi nativas.

Entregables estándar: Perfiles c(s), fracciones cuantitativas de especies, peso molecular o constantes de unión (según la modalidad), informes de métodos y resultados, y protocolos e informes de validación estructurados conforme a ICH.

La agregación es un atributo de calidad que ninguna columna por sí sola puede revelar por completo. Vuelva a colocar la muestra en su propio tampón y deje que sedimente una vez conforme a principios físicos fundamentales: a menudo, esto aporta la parte de la respuesta que «la SEC no puede explicar».

Si su programa se enfrenta a resultados de SEC cuestionados, datos insuficientes de comparabilidad con el producto original o preguntas sobre agregación de péptidos o AAV y cápsides vacías que requieren evidencia ortogonal, hable con nosotros. Para conocer plazos y precios, escriba a [email protected] o solicite un presupuesto en línea.

La AUC en tres frases

Es una medición in situ: Sin fase estacionaria, marcadores ni patrones: las moléculas se observan tal como están en solución, lo que ofrece una segunda opinión independiente a la SEC.
Primero la pregunta, después la modalidad: La SV responde sobre «distribución y fracciones»; la SE, sobre «peso molecular y afinidad». La pregunta determina el experimento, no el instrumento.
Es una comprobación cruzada, no un sustituto: Resulta óptima para verificar muestras críticas y atribuir datos controvertidos; dados el tiempo de ejecución y las limitaciones de las muestras, los ensayos rutinarios de alto rendimiento siguen dependiendo de la SEC.

Referencias

U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products. CDER/CBER, August 2014. fda.gov/media/85017/download
ICH. Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. Step 4, March 1999.
国家药典委员会. 中华人民共和国药典（2020 年版）三部：人用重组单克隆抗体制品总论. 北京：中国医药科技出版社, 2020. (Farmacopea china de 2020, vol. III: capítulo general sobre anticuerpos monoclonales recombinantes de uso humano.)
Uchiyama S. Aggregates Quantification of Biopharmaceuticals in a Wide Range of Sizes Using Orthogonal Methods. American Pharmaceutical Review, 2019. americanpharmaceuticalreview.com
Carpenter JF, Randolph TW, Jiskoot W, Crommelin DJ, Middaugh CR, Winter G. Potential inaccurate quantitation and sizing of protein aggregates by size exclusion chromatography: essential need to use orthogonal methods to assure the quality of therapeutic protein products. J Pharm Sci. 2010;99(5):2200–2208. doi:10.1002/jps.21989
den Engelsman J, Garidel P, Smulders R, et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm Res. 2011;28(4):920–933. doi:10.1007/s11095-010-0297-1
National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC), China. Development and validation of a sedimentation-velocity analytical ultracentrifugation method for size variants of monoclonal antibodies (en chino). (Se están actualizando los datos bibliográficos completos.)
Schuck P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biophys J. 2000;78(3):1606–1619. doi:10.1016/S0006-3495(00)76713-0
Uchiyama S, Noda M, Krayukhina E. Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation for characterization of therapeutic antibodies. Biophys Rev. 2018;10(2):259–269. doi:10.1007/s12551-017-0374-3
Best Practices for Aggregate Quantitation of Antibody Therapeutics by Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation. J Pharm Sci. 2022;111(7):2121–2133. doi:10.1016/j.xphs.2021.12.023
Berkowitz SA. Role of analytical ultracentrifugation in assessing the aggregation of protein biopharmaceuticals. AAPS J. 2006;8(3):E590–E605. doi:10.1208/aapsj080368