Nota de aplicação

AUC vs. SEC: o 1% do seu relatório realmente corresponde a 1% da sua amostra?

28 de setembro de 2026 · Leitura de aprox. 8 min

A SEC é a principal ferramenta para testes de agregados, mas detecta apenas a fração da amostra que atravessa a coluna sem sofrer alterações. A ultracentrifugação analítica (AUC) não utiliza coluna nem padrões e separa as moléculas a partir de princípios fundamentais, no próprio tampão de formulação. É exatamente por isso que órgãos reguladores e a indústria a utilizam como verificação ortogonal da SEC.

1. Quando a SEC indica “nenhum problema”, ainda pode haver um

A SEC (cromatografia de exclusão por tamanho) é o método de rotina para testes de agregados: rápida, de alto rendimento e reprodutível, com sensibilidade para agregados em níveis de até 0,1% — sendo a base do desenvolvimento e do controle de qualidade (CQ)^[4]. Entretanto, seus resultados apresentam, de forma inerente, quatro vieses:

Quatro vieses ocultos na operação de rotina

Diluição: A diluição antes e dentro da coluna pode dissociar dímeros reversivelmente associados^[9].
Fase móvel: Para obter bons formatos de pico, a SEC frequentemente utiliza fases móveis de alta força iônica, diferentes da formulação, o que altera a distribuição das espécies^[4],[9].
Interação com a fase estacionária: Interações inespecíficas entre a amostra e a resina podem tanto induzir nova agregação quanto reter na coluna agregados preexistentes^[5],[9].
Faixa de separação: As colunas convencionais de SEC abrangem uma faixa limitada de tamanhos.

O último viés tem um limite bem definido: a SEC é essencialmente uma etapa de filtração, e agregados maiores que aproximadamente 40–60 nm geralmente não conseguem atravessar o leito da coluna^[4],[5]. “1% no relatório de SEC” não significa “1% na amostra” — pode descrever apenas a fração que a coluna permitiu passar. Portanto, os resultados de SEC devem sempre ser verificados em relação à recuperação da amostra^[4].

Terminologia　O que a SEC “detecta” é limitado pela faixa de separação do leito da coluna; agregados acima do limite superior de poros são retidos por filtração antes do detector, portanto, “não detectado” ≠ “não presente”.

Figura 1. Nenhum método isolado abrange toda a faixa de tamanhos. A SEC detecta apenas a fração que a coluna permite passar; a SV-AUC não possui leito de coluna e captura agregados nanométricos na mesma distribuição (o segmento mais claro indica espécies maiores que exigem ajuste da velocidade do rotor). Esquema ilustrativo; as classes de tamanho seguem a classificação de Narhi et al. e as refs. [4], [9]; os limites dos métodos são valores típicos.

Ortogonalidade não é burocracia — é física

A orientação do FDA dos EUA sobre avaliação da imunogenicidade de produtos de proteínas terapêuticas recomenda métodos que, isoladamente ou em combinação, ampliem a detecção de agregados^[1]; a ICH Q6B inclui peso molecular, tamanho e agregados entre as propriedades físico-químicas e exige sua separação e quantificação^[2]; a Farmacopeia Chinesa de 2020 (Volume III, capítulo geral sobre anticorpos monoclonais recombinantes para uso humano) também relaciona variantes de tamanho como ensaio obrigatório^[3].

O consenso da indústria: a quantificação de agregados deve ser classificada por tamanho e contar com pelo menos dois métodos ortogonais — porque não existe um padrão de referência para agregados, e qualquer método isolado abrange apenas uma janela limitada de tamanhos; a concentração em cada janela deve ser verificada por um método baseado em um princípio de medição diferente^[4],[6].

Também há precedentes metodológicos publicados: o National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC, China) publicou o desenvolvimento e a validação de um método de SV-AUC para variantes de tamanho de anticorpos monoclonais, otimizando a velocidade do rotor, a temperatura e os parâmetros de processamento de dados, além de examinar sistematicamente especificidade, repetibilidade, precisão e linearidade^[7]. Os dados completos de validação do método estão disponíveis mediante solicitação.

2. AUC: uma corrida sem pista

A física da AUC é minimalista: aplica-se um campo centrífugo, observa-se em tempo real a redistribuição espacial das macromoléculas e analisam-se quantitativamente os dados a partir de princípios fundamentais. Sem marcação, sem modificação química e sem contato com qualquer matriz ou fase estacionária — o que a torna excepcionalmente suave para sistemas sensíveis a perturbações^[9],[11].

Figura 2. Ultracentrifugação analítica: separação em solução sem coluna ou marcadores. O sistema óptico varre a célula repetidamente durante a centrifugação, registrando a concentração em função do raio e do tempo; as espécies se separam naturalmente pelo coeficiente de sedimentação (uma função da massa, da forma e da densidade). Esquema ilustrativo, sem escala.

Dois modos: a velocidade de sedimentação ou a posição de equilíbrio

A velocidade de sedimentação (SV-AUC) acompanha a fronteira em movimento em alta velocidade do rotor e obtém uma distribuição contínua de coeficientes de sedimentação c(s) pelo ajuste direto da equação de Lamm^[8], resolvendo as espécies pelo valor de s — fornece tanto um perfil de composição quanto informações de forma em baixa resolução (razão de atrito). O equilíbrio de sedimentação (SE-AUC) aguarda, em velocidade mais baixa, até que sedimentação e difusão entrem em equilíbrio, fornecendo diretamente o peso molecular absoluto e a constante de associação K_D a partir do perfil de concentração no equilíbrio^[9],[11].

Dimensão	Velocidade de sedimentação (SV-AUC)	Equilíbrio de sedimentação (SE-AUC)
Configuração	Alta velocidade; acompanhamento do processo de sedimentação	Velocidade mais baixa; aguarda-se a distribuição de equilíbrio
Grandeza observada	Movimento da fronteira de sedimentação ao longo do tempo	Distribuição de concentração no equilíbrio
Resultado principal	Distribuição de coeficientes de sedimentação, frações das espécies	Peso molecular absoluto, constantes de ligação, estequiometria
Principais respostas	O que há na amostra e quanto há de cada espécie	Qual é o peso molecular e qual é a intensidade da ligação
Usos típicos	Quantificação de agregados, estado oligomérico, verificação ortogonal da SEC	Confirmação do peso molecular, termodinâmica de interações

Tabela 1 | Os dois modos são independentes tanto no planejamento quanto na análise: primeiro decida se você precisa de uma “distribuição” ou de uma “afinidade” e, em seguida, escolha o modo.

Pense assim: a SV coloca nadadores de diferentes biotipos na água ao mesmo tempo e observa quem afunda mais rápido; a SE espera até que todos parem de se mover e lê a profundidade em que cada um flutua. Uma mede a velocidade de sedimentação; a outra, a posição final de repouso.

Figura 3. Formatos dos dados brutos dos dois modos. A: na SV, a fronteira se move em direção ao fundo da célula ao longo do tempo — sua velocidade fornece o coeficiente de sedimentação e seu alargamento, a difusão — e o ajuste de c(s) converte esses dados em uma distribuição de espécies. B: na SE, sedimentação e difusão atingem o equilíbrio e a concentração aumenta exponencialmente ao longo do raio; o formato depende apenas do peso molecular e das interações, não da forma molecular.

3. Parâmetros, casos de uso e três concepções equivocadas comuns

Parâmetros reutilizáveis (respaldados por validação de método publicada)

Parâmetro	Valor	Fundamentação
Velocidade do rotor	50.000 rpm	Velocidade definida na otimização do método [7]
Temperatura	20 °C	Temperatura definida na otimização do método [7]
Sistema óptico / comprimento de onda	UV / 280 nm	A aquisição em múltiplos comprimentos de onda pode separar sinais de proteínas e ácidos nucleicos [7]
Resolução da grade c(s)	150	Resolução = 150 [7]
Faixa de valores de s	0,1 – 20 S	Limite superior s_max = 20 S [7]

Tabela 2 | Parâmetros de um método de SV-AUC publicado e validado [7]; ponto de partida de referência para métodos semelhantes. Formulações com açúcares/poliois e amostras de alta concentração exigem avaliação específica [9], [10].

Essas condições contam com um pacote completo de validação: repetibilidade com DPR de 0,91% em 6 execuções, precisão global com DPR de 0,78% e boa linearidade na faixa de 0,2–0,8 mg/mL^[7].

A SV-AUC fornece dados de especificidade, repetibilidade, precisão e linearidade — não é uma ferramenta de pesquisa apenas para “observar”, mas um método analítico que pode integrar dossiês regulatórios e resistir ao escrutínio da revisão; as melhores práticas publicadas já organizam a validação de SV-AUC no âmbito da ICH Q2^[10].

Figura 4. Distribuição c(s) por SV-AUC de uma amostra de anticorpo monoclonal (ilustrativa). Uma única execução lê fragmentos, monômero, dímero e agregados de ordem superior em um mesmo eixo; a integração de cada pico fornece sua fração relativa, e picos menores exigem teste de significância (por exemplo, estatística F) [9].

Perguntas que você pode encaminhar à AUC

Questões de decisão: Verificação da confiabilidade dos resultados de SEC; confirmação do estado oligomérico e da estequiometria; interações e constantes de ligação K_D; avaliação da propensão à agregação durante a triagem de formulações; dados ortogonais para consistência de liberação, mudanças e comparabilidade com o produto originador.
Tipos de amostras: Anticorpos monoclonais / biespecíficos / proteínas de fusão Fc; peptídeos (agonistas do receptor de GLP-1); vetores virais (AAV / VLP — o sistema óptico de múltiplos comprimentos de onda resolve capsídeos vazios, parciais e cheios e estima o conteúdo de ácido nucleico); ADCs; proteínas não anticorpos, como colágeno.

Tipo de amostra	Perguntas respondidas
Anticorpo monoclonal / biespecífico / proteína de fusão Fc	Agregados, fragmentos, consistência entre lotes, triagem de tampões de formulação, verificação dos resultados de SEC
Peptídeos (agonistas do receptor de GLP-1)	Heterogeneidade de pureza, avaliação da propensão à agregação, validação de método para submissões nos EUA
Vetores virais (AAV / VLP)	Resolução por múltiplos comprimentos de onda de partículas vazias / parciais / cheias, com estimativa do conteúdo de ácido nucleico; controle de agregados
ADC	Variantes de tamanho e comportamento de agregação após a conjugação de cargas hidrofóbicas; confirmação ortogonal de atributos relacionados à conjugação
Colágeno e outras proteínas não anticorpos	Análise de agregados e do estado de montagem em condições próximas às nativas
Interações proteicas / complexos de ácido nucleico	Razões antígeno–anticorpo, K_D de ligante–receptor, complexos proteína–ácido nucleico

Tabela 3 | A lista de cenários resume nosso escopo de serviços; a adequação a uma amostra específica requer avaliação do método.

Três concepções equivocadas comuns

Concepção equivocada 1: “A SEC já mediu os agregados — a AUC é trabalho duplicado.”

Os mecanismos de separação e o estado físico da amostra são completamente diferentes: a AUC não tem fase estacionária, mede no tampão de formulação e detecta espécies que a coluna de SEC não permite passar. A AUC é uma verificação cruzada da SEC, não uma repetição^[1],[9],[10].

Concepção equivocada 2: “A AUC serve apenas para peso molecular.”

A SV se concentra nas distribuições de espécies; a SE, no peso molecular e nos parâmetros termodinâmicos — são desenhos experimentais e fluxos de dados totalmente diferentes^[11].

Concepção equivocada 3: “Se os dois métodos divergem, o experimento foi mal executado.”

Muito pelo contrário — a própria discrepância é o ponto central. Especialmente em amostras submetidas a estresse por calor, agitação ou sacudidas, SEC e SV-AUC frequentemente divergem, e isso sinaliza espécies que a execução de SEC não recuperou: uma pista diagnóstica que precisa ser investigada^[4],[9].

4. Serviços analíticos da Quickgene: oferta e entregáveis de AUC

Nossa plataforma de ultracentrifugação analítica abrange desenvolvimento de métodos, validação completa de métodos, testes de rotina e ajuste de dados — todas as etapas já aplicadas em projetos regulatórios. Trabalhos representativos incluem:

Registro de produtos peptídicos nos EUA: Validação completa de métodos de SV-AUC para semaglutida, tirzepatida e outros (especificidade, precisão, exatidão, limite de quantificação, linearidade e faixa, robustez);
Testes de liberação de AAV: Discriminação e quantificação de capsídeos vazios / parciais / cheios e controle de agregados — com entrega da validação completa do método;
Submissões de BLA para medicamentos anticorpos: Desenvolvimento e validação de métodos de SV-AUC para variantes de tamanho em suporte aos dossiês de submissão;
Caracterização de ADCs: Avaliação de variantes de tamanho e agregação após a conjugação de cargas hidrofóbicas, com confirmação ortogonal de atributos relacionados à conjugação em conjunto com LC-MS;
Colágeno e outras proteínas recombinantes: Análise de agregados e do estado de montagem em condições próximas às nativas.

Entregáveis padrão: Perfis c(s), frações quantitativas das espécies, peso molecular ou constantes de ligação (conforme o modo), relatórios de métodos e resultados, além de protocolos e relatórios de validação estruturados conforme a ICH.

A agregação é um atributo de qualidade que nenhuma coluna isolada consegue revelar por completo. Coloque a amostra de volta em seu próprio tampão e deixe-a sedimentar uma vez segundo princípios fundamentais — isso frequentemente fornece a parte da resposta que “a SEC não consegue explicar”.

Se o seu programa enfrenta resultados de SEC contestados, dados insuficientes de comparabilidade com o produto originador ou questões de agregação de peptídeos/AAV e capsídeos vazios que exigem evidências ortogonais, fale conosco. Para prazos e preços, envie um e-mail para [email protected] ou solicite uma cotação on-line.

AUC em três frases

É uma medição in situ: Sem fase estacionária, sem marcadores e sem padrões — você observa as moléculas como estão em solução, oferecendo à SEC uma segunda opinião independente.
Primeiro a pergunta, depois o modo: A SV responde “distribuição e frações”; a SE responde “peso molecular e afinidade”. O experimento é determinado pela pergunta, não pelo instrumento.
É uma verificação cruzada, não uma substituição: Ideal para verificar amostras críticas e atribuir a origem de dados controversos; devido ao tempo de execução e às restrições de amostra, os testes rotineiros de alto rendimento ainda dependem da SEC.

Referências

U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products. CDER/CBER, August 2014. fda.gov/media/85017/download
ICH. Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. Step 4, March 1999.
国家药典委员会. 中华人民共和国药典（2020 年版）三部：人用重组单克隆抗体制品总论. 北京：中国医药科技出版社, 2020. (Farmacopeia Chinesa de 2020, Vol. III — capítulo geral sobre anticorpos monoclonais recombinantes para uso humano.)
Uchiyama S. Aggregates Quantification of Biopharmaceuticals in a Wide Range of Sizes Using Orthogonal Methods. American Pharmaceutical Review, 2019. americanpharmaceuticalreview.com
Carpenter JF, Randolph TW, Jiskoot W, Crommelin DJ, Middaugh CR, Winter G. Potential inaccurate quantitation and sizing of protein aggregates by size exclusion chromatography: essential need to use orthogonal methods to assure the quality of therapeutic protein products. J Pharm Sci. 2010;99(5):2200–2208. doi:10.1002/jps.21989
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National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC), China. Development and validation of a sedimentation-velocity analytical ultracentrifugation method for size variants of monoclonal antibodies (em chinês). (Dados bibliográficos completos em atualização.)
Schuck P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biophys J. 2000;78(3):1606–1619. doi:10.1016/S0006-3495(00)76713-0
Uchiyama S, Noda M, Krayukhina E. Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation for characterization of therapeutic antibodies. Biophys Rev. 2018;10(2):259–269. doi:10.1007/s12551-017-0374-3
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