Руководство EMA по синтетическим пептидам: пороги примесей, характеристика и ортогональный анализ

1 Основные сведения

2 Примеси: типы и пороги

• Пороги: примеси, связанные с пептидом, указываются выше 0,1%, идентифицируются выше 0,5% и квалифицируются выше 1,0% со ссылкой на Ph. Eur. 2034; ICH Q3A/B не применяются.
• Совместно элюирующиеся и неразделённые пики: если несколько примесей дают один пик, пороги применяются к суммарному пику, если не обосновано иное.
• Перечисленные типы примесей: стереоизомеры (эпимеризация), делеционные, укороченные (ацетилированные) и инсерционные последовательности; продукты деградации — окисление, гидролиз, изомеризация, дезамидирование, аспартимид, дикетопиперазин и пироглутаминовая кислота; высокомолекулярные примеси — агрегаты, димеры, олигомеры.
• Непептидные примеси: технологические реагенты, остаточные растворители, элементные примеси, мутагенные примеси и нитрозамины.

3 Спецификации и характеристика

• Высокомолекулярные примеси: нормируются по типам (например, димеры, агрегаты); единый показатель «высокомолекулярные примеси» неприемлем. Названный здесь метод — эксклюзионная ВЭЖХ (SEC).
• Идентификация: рекомендуются не менее двух ортогональных методов; для методов определения примесей изучаются стабильность-индицирующие свойства и баланс масс, а чувствительность должна достигать порога указания 0,1%.
• Характеристика: первичная структура — МС, ЖХ-МС/МС, аминокислотный анализ, ЯМР, деградация по Эдману; вторичная — КД в дальнем УФ, ИК-Фурье, ЯМР; третичная — КД в ближнем УФ и ЯМР; агрегация — тест с ThT и собственная флуоресценция триптофана.
• Прочее: содержание противоиона требует обоснованного верхнего предела; количественное содержание обычно выражают в пересчёте на безводное вещество без противоиона; биологические тесты для выпуска и стабильности, как правило, не требуются.

4 Синтетические пептиды с биологическим референтом (раздел 6)

Это раздел с наибольшим влиянием на пептидные дженерики. Химически синтезированный пептид не может идти путём биоаналога; вместо этого его сравнивают с референтным препаратом, закупленным на рынке ЕС:

1. Структура: полный аналитический набор по первичной структуре и структуре высшего порядка; методы высшего порядка включают КД, ИК-Фурье, 2D ЯМР, флуоресценцию и ДСК.
2. Чистота: ортогональные методы по размеру, заряду и гидрофобности; при необходимости — тест с ThT.
3. Примеси: каждая примесь, связанная с пептидом, на уровне 0,1–0,5% сравнивается с референтом; отсутствующие в референте не должны вызывать опасений по иммуногенности и квалифицируются выше 1,0%.
4. Иммуногенность: могут помочь предсказание связывания с Т-клеточным рецептором in silico или тесты активации Т-клеток in vitro.
5. Стресс-тесты: сравнительные исследования, включая сдвиговое/механическое воздействие.
6. Функция: следует использовать клеточные тесты.
7. Стабильность: срок годности нельзя выводить из данных референта.

5 Исследуемые лекарственные препараты (раздел 7)

• Контролировать отдельные примеси в аминокислотных строительных блоках с ранних этапов; пределы по критичности ожидаются на фазах II/III.
• На фазе I для высокомолекулярных примесей допустима оценка риска на основе имеющихся знаний; на фазах II/III нужны экспериментальные данные.
• Примеси, связанные с пептидом, выше 1,0% идентифицировать и квалифицировать в доклинических исследованиях; рано применять ортогональные и стабильность-индицирующие методы.

6 Что это значит для аналитической работы

1. Высокомолекулярные примеси контролируются по типам

   Раздел 4.4

   Рекомендуемый пакет данных

   Тип и уровень агрегатов

   Методы

   Количественное определение SEC и метод без колонки для подтверждения типа агрегатов (АУЦ в руководстве не названо; это наша рекомендуемая ортогональная проверка)

   Quickgene предлагает

   Анализ агрегации и самоассоциации методом SV-AUC

2. Сравнение структуры высшего порядка

   Раздел 4.3, 6

   Рекомендуемый пакет данных

   Количественное сходство вторичной и третичной структуры (корреляция, RMSD)

   Методы

   КД в дальнем и ближнем УФ

   Quickgene предлагает

   Круговой дихроизм (КД)

3. Ортогональная чистота по заряду

   Раздел 6

   Рекомендуемый пакет данных

   Распределение зарядовых вариантов и сравнение кажущейся pI

   Методы

   icIEF

   Quickgene предлагает

   pI и зарядовая гетерогенность методом icIEF

4. Клеточные функциональные тесты

   Раздел 6

   Рекомендуемый пакет данных

   Кривая «доза–эффект» активации рецептора и относительная активность

   Методы

   Клеточные тесты с репортёрным геном

   Quickgene предлагает

   Клеточные тесты активности; репортёрная клеточная линия CHO-GLP-1

5. Сравнение по каждой примеси на уровне 0,1–0,5%

   Раздел 6

   Рекомендуемый пакет данных

   Расположение известных примесей и специфичность метода

   Методы

   ОФ-ВЭЖХ, ЖХ-МС со стандартами примесей

   Quickgene предлагает

   Стандарты примесей семаглутида, тирзепатида и ретатрутида

6. Иммуногенность примесей, отсутствующих в референте

   Раздел 6

   Рекомендуемый пакет данных

   Данные об иммуногенности примесей

   Методы

   Тесты активации Т-клеток in vitro с высокочистыми примесями

   Quickgene предлагает

   Синтез высокочистых примесей на заказ для тестов иммуногенности

7 Часто задаваемые вопросы

• Как руководство связано с Ph. Eur. 2034? Оно принимает пороги 0,1% / 0,5% / 1,0% из 2034 и добавляет специфичные для пептидов требования к совместно элюирующимся пикам, высокомолекулярным примесям и сравнению с биологическими референтами.
• Чем оно отличается от требований FDA? Руководство FDA 2021 г. охватывает лишь пять дженериков с референтом рекомбинантного происхождения и сосредоточено на сравнении по каждой примеси с пределом 0,5% для новых примесей; руководство EMA охватывает новые субстанции, дженерики и материалы клинических исследований. Сравнение трёх регионов — на странице регуляторных требований.

Литература