Guía de la EMA sobre péptidos sintéticos: umbrales de impurezas, caracterización y análisis ortogonal

1 Datos clave

2 Impurezas: tipos y umbrales

• Umbrales: las impurezas relacionadas con el péptido se notifican por encima del 0,1 %, se identifican por encima del 0,5 % y se cualifican por encima del 1,0 %, citando Ph. Eur. 2034; ICH Q3A/B no se aplican.
• Picos coeluyentes y no resueltos: si varias impurezas forman un solo pico, los umbrales se aplican al pico combinado salvo justificación.
• Tipos de impurezas relacionadas citados: estereoisómeros (epimerización), secuencias de deleción, secuencias truncadas (acetiladas), secuencias de inserción; productos de degradación como oxidación, hidrólisis, isomerización, desamidación, aspartimida, dicetopiperazina y ácido piroglutámico; e impurezas de alto peso molecular como agregados, dímeros y oligómeros.
• Impurezas no peptídicas: reactivos de proceso, disolventes residuales, impurezas elementales, impurezas mutagénicas y nitrosaminas.

3 Especificaciones y caracterización

• Impurezas de alto peso molecular: deben especificarse por tipo (p. ej., dímeros, agregados); un único parámetro «impurezas de alto peso molecular» no es aceptable. El método citado aquí es la SEC.
• Identificación: se recomiendan al menos dos métodos ortogonales; los métodos de impurezas deben estudiarse en cuanto a capacidad indicadora de estabilidad y balance de masas, y alcanzar el umbral de notificación del 0,1 %.
• Caracterización: estructura primaria por MS, LC-MS/MS, análisis de aminoácidos, RMN y degradación de Edman; estructura secundaria por DC en UV lejano, FTIR y RMN; estructura terciaria por DC en UV cercano y RMN; agregación por ensayo con ThT y fluorescencia intrínseca del triptófano.
• Otros: el contenido de contraión necesita un límite superior justificado; la valoración se expresa normalmente sin contraión y en base anhidra; en general no se exigen ensayos biológicos para liberación y estabilidad.

4 Péptidos sintéticos con un producto biológico de referencia (sección 6)

Es la sección con mayor impacto en los péptidos genéricos. Un péptido de síntesis química no puede seguir la vía de biosimilares; en su lugar se compara con un producto de referencia adquirido en el mercado de la UE:

1. Estructura: un panel analítico completo de estructura primaria y de orden superior; los métodos de orden superior incluyen DC, FTIR, RMN 2D, fluorescencia y DSC.
2. Pureza: métodos ortogonales basados en tamaño, carga e hidrofobicidad; ensayo con ThT cuando proceda.
3. Impurezas: cada impureza relacionada entre 0,1 y 0,5 % se compara con la referencia; las ausentes en la referencia no deben plantear problemas de inmunogenicidad y se cualifican por encima del 1,0 %.
4. Inmunogenicidad: pueden ayudar la predicción in silico de unión al receptor de células T o los ensayos de activación de células T in vitro.
5. Degradación forzada: estudios comparativos, incluido el estrés mecánico o por cizalla.
6. Función: deben usarse ensayos celulares.
7. Estabilidad: la vida útil no puede derivarse del producto de referencia.

5 Medicamentos en investigación (sección 7)

• Controlar las impurezas individuales de los bloques de aminoácidos desde el inicio del desarrollo; los límites basados en criticidad se esperan en las fases II/III.
• En fase I puede usarse una evaluación de riesgo basada en conocimiento previo para las impurezas de alto peso molecular; en fases II/III se necesitan datos experimentales.
• Identificar las impurezas relacionadas por encima del 1,0 % y cualificarlas en estudios no clínicos; usar pronto métodos ortogonales e indicadores de estabilidad.

6 Qué implica para el trabajo analítico

1. Impurezas de alto peso molecular controladas por tipo

   Sección 4.4

   Paquete de datos sugerido

   Tipo y nivel de agregados

   Métodos

   Cuantificación por SEC, con un método sin columna para confirmar el tipo de agregado (la guía no menciona la AUC; es nuestra comprobación ortogonal recomendada)

   Quickgene ofrece

   Análisis de agregación y autoasociación por SV-AUC

2. Comparación de la estructura de orden superior

   Sección 4.3, 6

   Paquete de datos sugerido

   Similitud cuantitativa de estructura secundaria y terciaria (correlación, RMSD)

   Métodos

   DC en UV lejano y cercano

   Quickgene ofrece

   Dicroísmo circular (DC)

3. Pureza ortogonal basada en la carga

   Sección 6

   Paquete de datos sugerido

   Distribución de variantes de carga y comparación del pI aparente

   Métodos

   icIEF

   Quickgene ofrece

   pI y heterogeneidad de carga por icIEF

4. Ensayos funcionales celulares

   Sección 6

   Paquete de datos sugerido

   Curva dosis-respuesta de activación del receptor y potencia relativa

   Métodos

   Ensayos celulares con gen reportero

   Quickgene ofrece

   Ensayos de potencia celulares; línea celular reportera CHO-GLP-1

5. Comparación impureza por impureza entre 0,1 y 0,5 %

   Sección 6

   Paquete de datos sugerido

   Localización de impurezas conocidas y especificidad del método

   Métodos

   RP-HPLC, LC-MS con estándares de impurezas

   Quickgene ofrece

   Estándares de impurezas de semaglutide, tirzepatide y retatrutide

6. Inmunogenicidad de impurezas ausentes en la referencia

   Sección 6

   Paquete de datos sugerido

   Datos de inmunogenicidad de las impurezas

   Métodos

   Ensayos de activación de células T in vitro con impurezas de alta pureza

   Quickgene ofrece

   Síntesis a medida de impurezas de alta pureza para ensayos de inmunogenicidad

7 Preguntas frecuentes

• ¿Qué relación tiene la guía con Ph. Eur. 2034? Adopta los umbrales de 0,1 % / 0,5 % / 1,0 % de la 2034 y añade requisitos propios de los péptidos sobre picos coeluyentes, impurezas de alto peso molecular y comparación con productos de referencia biológicos.
• ¿En qué se diferencia de la FDA? La guía de la FDA de 2021 cubre solo cinco genéricos cuya referencia es de origen ADNr y se centra en la comparación impureza por impureza, con un límite del 0,5 % para impurezas nuevas; la guía de la EMA abarca principios activos nuevos, genéricos y material de ensayos clínicos. Consulte la página de requisitos regulatorios para una comparación de las tres regiones.

Referencias