Guia da EMA sobre peptídeos sintéticos: limiares de impurezas, caracterização e análise ortogonal

1 Fatos principais

2 Impurezas: tipos e limiares

• Limiares: impurezas relacionadas ao peptídeo são notificadas acima de 0,1%, identificadas acima de 0,5% e qualificadas acima de 1,0%, citando a Ph. Eur. 2034; as ICH Q3A/B não se aplicam.
• Picos coeluídos e não resolvidos: quando várias impurezas formam um só pico, os limiares se aplicam ao pico combinado, salvo justificativa.
• Tipos de impurezas relacionadas citados: estereoisômeros (epimerização), sequências de deleção, sequências truncadas (acetiladas), sequências de inserção; produtos de degradação como oxidação, hidrólise, isomerização, desamidação, aspartimida, dicetopiperazina e ácido piroglutâmico; e impurezas de alto peso molecular como agregados, dímeros e oligômeros.
• Impurezas não peptídicas: reagentes de processo, solventes residuais, impurezas elementares, impurezas mutagênicas e nitrosaminas.

3 Especificações e caracterização

• Impurezas de alto peso molecular: devem ser especificadas por tipo (por exemplo, dímeros, agregados); um único parâmetro «impurezas de alto peso molecular» não é aceito. O método citado aqui é a SEC.
• Identificação: recomendam-se ao menos dois métodos ortogonais; os métodos de impurezas devem ter estudada a capacidade indicadora de estabilidade e o balanço de massa, e atingir o limiar de notificação de 0,1%.
• Caracterização: estrutura primária por MS, LC-MS/MS, análise de aminoácidos, RMN e degradação de Edman; estrutura secundária por DC no UV distante, FTIR e RMN; estrutura terciária por DC no UV próximo e RMN; agregação por ensaio com ThT e fluorescência intrínseca do triptofano.
• Outros: o teor de contraíon precisa de limite superior justificado; o doseamento é normalmente expresso sem contraíon e em base anidra; em geral não se exigem ensaios biológicos para liberação e estabilidade.

4 Peptídeos sintéticos com produto biológico de referência (seção 6)

É a seção de maior impacto para peptídeos genéricos. Um peptídeo de síntese química não pode seguir a via de biossimilares; em vez disso, é comparado com um produto de referência adquirido no mercado da UE:

1. Estrutura: painel analítico completo de estrutura primária e de ordem superior; os métodos de ordem superior incluem DC, FTIR, RMN 2D, fluorescência e DSC.
2. Pureza: métodos ortogonais baseados em tamanho, carga e hidrofobicidade; ensaio com ThT quando pertinente.
3. Impurezas: cada impureza relacionada entre 0,1 e 0,5% é comparada com a referência; as ausentes na referência não devem levantar preocupação de imunogenicidade e são qualificadas acima de 1,0%.
4. Imunogenicidade: podem ajudar a predição in silico de ligação ao receptor de células T ou ensaios de ativação de células T in vitro.
5. Degradação forçada: estudos comparativos, incluindo estresse mecânico ou de cisalhamento.
6. Função: devem ser usados ensaios celulares.
7. Estabilidade: o prazo de validade não pode ser derivado do produto de referência.

5 Medicamentos experimentais (seção 7)

• Monitorar impurezas individuais nos blocos de aminoácidos desde o início do desenvolvimento; limites baseados em criticidade são esperados nas fases II/III.
• Na fase I pode-se usar avaliação de risco baseada em conhecimento prévio para impurezas de alto peso molecular; nas fases II/III são necessários dados experimentais.
• Identificar impurezas relacionadas acima de 1,0% e qualificá-las em estudos não clínicos; usar cedo métodos ortogonais e indicadores de estabilidade.

6 O que muda no trabalho analítico

1. Impurezas de alto peso molecular controladas por tipo

   Seção 4.4

   Pacote de dados sugerido

   Tipo e nível de agregados

   Métodos

   Quantificação por SEC, com um método sem coluna para confirmar o tipo de agregado (o guia não cita a AUC; é a nossa verificação ortogonal recomendada)

   A Quickgene oferece

   Análise de agregação e autoassociação por SV-AUC

2. Comparação da estrutura de ordem superior

   Seção 4.3, 6

   Pacote de dados sugerido

   Similaridade quantitativa de estrutura secundária e terciária (correlação, RMSD)

   Métodos

   DC no UV distante e próximo

   A Quickgene oferece

   Dicroísmo circular (DC)

3. Pureza ortogonal baseada em carga

   Seção 6

   Pacote de dados sugerido

   Distribuição de variantes de carga e comparação do pI aparente

   Métodos

   icIEF

   A Quickgene oferece

   pI e heterogeneidade de carga por icIEF

4. Ensaios funcionais celulares

   Seção 6

   Pacote de dados sugerido

   Curva dose-resposta de ativação do receptor e potência relativa

   Métodos

   Ensaios celulares com gene repórter

   A Quickgene oferece

   Ensaios de potência celulares; linhagem celular repórter CHO-GLP-1

5. Comparação impureza por impureza entre 0,1 e 0,5%

   Seção 6

   Pacote de dados sugerido

   Localização de impurezas conhecidas e especificidade do método

   Métodos

   RP-HPLC, LC-MS com padrões de impurezas

   A Quickgene oferece

   Padrões de impurezas de semaglutide, tirzepatide e retatrutide

6. Imunogenicidade de impurezas ausentes na referência

   Seção 6

   Pacote de dados sugerido

   Dados de imunogenicidade das impurezas

   Métodos

   Ensaios de ativação de células T in vitro com impurezas de alta pureza

   A Quickgene oferece

   Síntese sob medida de impurezas de alta pureza para ensaios de imunogenicidade

7 Perguntas frequentes

• Qual a relação do guia com a Ph. Eur. 2034? Adota os limiares de 0,1% / 0,5% / 1,0% da 2034 e acrescenta requisitos próprios de peptídeos sobre picos coeluídos, impurezas de alto peso molecular e comparação com produtos de referência biológicos.
• Em que difere da FDA? O guia da FDA de 2021 cobre apenas cinco genéricos cuja referência é de origem rDNA e foca na comparação impureza por impureza, com limite de 0,5% para impurezas novas; o guia da EMA abrange ativos novos, genéricos e material de ensaios clínicos. Veja a página de requisitos regulatórios para a comparação das três regiões.

Referências