应用笔记

AUC 复核 SEC：报告上的 1%，样品里真有 1% 吗？

2026 年 9 月 28 日 · 阅读约 8 分钟

SEC 是聚集体检测的主力，但它只能看见“能通过柱子、且没被柱子改变”的那部分样品。分析型超速离心（AUC）不用色谱柱、不用标准品，在样品自身缓冲液中按第一性原理分离——这正是它被监管与业界用作 SEC 正交复核的原因。

一、SEC 说“没问题”，未必真没问题

SEC（分子排阻色谱）是聚集体检测的常规手段：快速、高通量、重现性好，可检出 0.1% 量级的聚集体，是开发与质控的主力方法[4]。但它的结果天然携带四项偏差：

四项偏差，藏在常规操作里

  • 稀释：上柱前与柱内的稀释，可能让可逆缔合的二聚体解离[9]；
  • 流动相：为获得好的峰形，SEC 常用高离子强度流动相，与处方不同，各组分分布随之改变[4],[9]；
  • 固定相作用：样品与填料的非特异性作用，既可能诱发新的聚集，也可能把原有聚集体截留在柱上[5],[9]；
  • 分离范围：常规 SEC 柱的分离范围有限。

最后一项有明确边界：SEC 本质上相当于一道过滤，粒径超过约 40–60 nm 的聚集体通常无法通过柱床[4],[5]。SEC 报告 1%，不等于样品里只有 1%——它可能只是“能通过这根柱子的那部分”。因此，SEC 结果应同时核对样品回收率[4]。

术语边界　SEC 的“检出”受柱床分离范围约束；超过柱孔上限的聚集体被直接滤掉、不进入检测器，因此“未检出”≠“不存在”。
SEC 排阻上限 ≈ 40–60 nmSECSV-AUCDLS / AF4-MALSNTA / RMM流式成像 FIM光阻法 LO1 nm10 nm100 nm1 μm10 μm100 μm聚集体粒径（对数坐标）　纳米级 <100 nm ｜ 亚微米 100 nm–1 μm ｜ 微米级 1–100 μmIgG ≈ 14 nm
图 1　没有一种方法能覆盖全部粒径。 SEC 只能看到柱子放行的那一段；SV-AUC 无柱床，可把纳米级聚集体完整纳入同一张分布图（浅色段表示需调整转速才能覆盖的较大组分）。示意图，粒径分区参照 Narhi 等的分类及文献 [4]、[9] 整理，各方法边界为典型值。

正交不是行政规定，是物理根源

美国 FDA《治疗性蛋白产品免疫原性评价指南》建议采用单独或组合使用能够增强聚集体检出的方法[1]；ICH Q6B 把分子量、尺寸与聚集体归入理化性质项，要求分离并定量[2]；《中国药典》2020 年版三部“人用重组单克隆抗体制品总论”亦将分子大小变异体列为必检项[3]。

行业共识是：聚集体定量应依据粒径分类，并采用至少两种正交方法——因为不存在聚集体标准品，任何单一方法都只能覆盖有限粒径区间，某一区间的浓度须由另一检测原理的方法验证[4],[6]。

方法层面已有公开权威依据：中国食品药品检定研究院已发表单抗分子大小变异体 SV-AUC 的方法建立与验证论文，对转速、温度与数据处理参数作了优化，并系统考察专属性、重复性、精密度与线性[7]。完整方法学验证数据可联系索取。

二、AUC：一场没有跑道的赛跑

AUC 的物理图景极简：施加离心力，实时观测大分子在空间上的重新分布，再基于第一性原理对数据做定量分析。它不需要标记、不需化学修饰、不与任何基质或固定相接触，对扰动敏感的体系格外友好[9],[11]。

离心力高速旋转　约 50,000 r/min转子与样品池（图中高亮池放大见右）样品池放大：同一溶液中按沉降速度分离弯月面池底单体沉降界面离心力方向：聚集体（大）沉得最快，片段（小）最慢紫外 / 干涉逐时径向扫描 → 浓度分布片段单体聚集体
图 2　分析型超速离心：在溶液中原位分离，不接触色谱柱、不需标记。 光学系统在离心过程中反复扫描样品池，记录浓度随半径与时间的变化；组分按沉降系数（与质量、形状、密度相关）自然分开。示意图，非比例绘制。

两种模式：看沉多快，还是停在哪

沉降速度法 SV-AUC 在高转速下跟踪沉降界面，通过对 Lamm 方程的直接拟合得到连续的沉降系数分布 c(s)[8]，把不同组分按沉降系数分开——它既是组成谱，也携带分子形状（摩擦比）等低分辨结构信息。沉降平衡法 SE-AUC 在较低转速下等待沉降与扩散达到平衡，由平衡浓度分布直接给出绝对分子量与结合常数 KD[9],[11]。

维度沉降速度 SV-AUC沉降平衡 SE-AUC
实验条件高转速，跟踪沉降过程较低转速，等待平衡分布
观察对象沉降边界随时间的移动平衡状态的浓度分布
主要输出沉降系数分布、各组分比例绝对分子量、结合常数、化学计量
适合回答组成是什么、各占多少分子量是多少、结合有多强
典型用途聚集体定量、寡聚状态、与 SEC 正交复核分子量确认、相互作用热力学分析

表 1 ｜ 两种模式实验设计与数据分析相互独立：先想清要回答“分布”还是“亲和力”，再选方案。

可以这样理解：SV 是让一群体型不同的选手同时入水，看谁沉得快；SE 是等所有人停稳，看他们最终停在哪个深度。一个测“沉降得多快”，一个测“最终停在哪里”。
A　SV：沉降界面随时间推进半径 r →（池底）吸光度 A₂₈₀t₁ → t₆ 逐次扫描B　SE：平衡后的指数型分布半径 r →（池底）ln c 对 r² 的斜率 ∝ 浮力分子量 M(1−v̄ρ)多转速全局拟合 → 分子量与结合常数
图 3　两种模式的原始数据形态。 A：SV 中界面随时间向池底移动，界面的移动速度给出沉降系数、展宽给出扩散信息，经 c(s) 拟合转换为组分分布；B：SE 中沉降与扩散达到平衡，浓度沿半径呈指数上升，其形状只取决于分子量与相互作用，与分子形状无关。

三、参数、问题清单与三大误区

可复用参数（已见方法学验证）

参数取值依据
转速50,000 r/min方法学优化所得转速 [7]
温度20 ℃方法学优化所得温度 [7]
检测模块 / 波长紫外 / 280 nm可多波长采集，区分蛋白与核酸信号 [7]
c(s) 网格分辨率150Resolution = 150 [7]
s 值范围0.1 – 20 S上界 smax = 20 S [7]

表 2 ｜ 参数来自已发表的 SV-AUC 方法学优化 [7]，可作为同类方法建立的参考起点；含糖/多元醇处方、高浓度样品需另行评估 [9]、[10]。

这套条件背后有完整的验证数据：6 次重复性实验 RSD 0.91%，总体精密度 RSD 0.78%，0.2–0.8 mg/mL 区间线性良好[7]。

SV-AUC 能拿出专属性、重复性、精密度与线性数据——它不是只能“看一下”的研究工具，而是能写进申报资料、经得起审评追问的分析方法；业界已有按 ICH Q2 框架组织 SV-AUC 方法验证的最佳实践可循[10]。

05101520沉降系数 s₂₀,w（S）c(s)（归一化）单体 ~6.6 S　97.9%片段 ~4.2 S0.6%二聚体 ~9.6 S　1.2%高聚体 >12 S　0.3%虚线：次要组分放大 10×
图 4　单抗样品的 SV-AUC c(s) 分布（示意）。 一次实验即可在同一坐标上读出片段、单体、二聚体与更高聚体，各峰面积积分即为相对含量；次要峰需结合 F 统计等方法评估显著性 [9]。

哪些问题可以交给 AUC

  • 决策类：SEC 结果可信度复核；寡聚状态与化学计量确认；相互作用与结合常数 KD；处方筛选期聚集倾向评估；放行一致性、变更与原研比对所需的正交数据。
  • 样品类：单抗／双抗／融合蛋白；多肽类（GLP-1 受体激动剂）；病毒载体（AAV／VLP，多波长可同时解析空壳、部分包装、完整颗粒并推算核酸含量）；ADC；胶原蛋白等非抗体蛋白。
样品类型可回答的问题
单抗 / 双抗 / 融合蛋白聚集体、片段、批间一致性、制剂缓冲筛选、SEC 结果复核
多肽类（GLP-1 受体激动剂）纯度异质性、聚集倾向评估、对美注册方法验证
病毒载体（AAV / VLP）多波长解析空壳、部分包装、完整颗粒并推算核酸含量；聚集体控制
ADC疏水性载荷引入后的分子大小变异体与聚集行为、偶联相关属性正交确证
胶原蛋白等非抗体蛋白近原液条件下的聚集体与组装状态分析
蛋白互作 / 核酸复合体抗原抗体比例、配体-受体 KD、蛋白-核酸复合体

表 3 ｜ 场景清单为服务范围概述，具体样品的适用性需经方法评估确认。

三个常见误区

误区一：“SEC 测过聚集体，AUC 是重复劳动”
两者分离机理与样品所处状态都不同：AUC 无固定相、可在处方缓冲液中测定，并能看到 SEC 柱无法放行的组分。AUC 是对 SEC 的复核，不是重复[1],[9],[10]。
误区二：“AUC 就是测分子量的”
SV 侧重组分分布，SE 侧重分子量与热力学参数，实验设计与数据路径完全不同[11]。
误区三：“两个方法数字对不上，是实验没做好”
恰恰相反，差异本身正是关键所在——尤其在热、搅拌、振荡等应力样品中，SEC 与 SV-AUC 结果不一致很常见，它提示样品中存在 SEC 未能回收的组分，是必须调查的诊断线索[4],[9]。

四、Quickgene 分析服务：AUC 服务与交付

我们的分析型超速离心平台覆盖方法建立、全套方法学验证、日常检测与数据拟合，各环节均已在申报项目中验证。代表性工作包括：

  • 多肽类产品对美注册——已完成司美格鲁肽、替尔泊肽等的 SV-AUC 检测方法全套验证（专属性、精密度、准确度、定量限、线性与范围、耐用性）；
  • AAV 放行检测——空壳／部分包装／完整颗粒的区分与定量、聚集体控制，全套方法验证已交付；
  • 抗体类药物 BLA 申报——承担分子大小变异体 SV-AUC 方法的建立与验证，支持申报资料；
  • ADC 表征——疏水性载荷引入后的分子大小变异体与聚集行为评估，配合色谱质谱完成偶联相关属性正交确证；
  • 胶原蛋白及其他重组蛋白——近原液条件下的聚集体与组装状态分析。

标准交付物：c(s) 图谱、各组分定量比例、分子量或结合常数（视模式而定）、方法学与结果报告，以及按 ICH 要求组织的方法验证方案与报告。

查看 SV-AUC 聚集体与自缔合分析服务

聚集体不是靠一根柱子就能彻底看清的质量属性。把样品放回它自己的缓冲液，让它在离心场中按第一性原理沉降一次，往往能补上“SEC 说不清”的那部分答案。

若您的项目正面临 SEC 结果被问询、与原研比对数据不足，或多肽／AAV 的聚集体与空壳率需要正交数据，欢迎联系我们。交付周期与报价请邮件咨询 [email protected]，或在线提交询价。

三句话记住 AUC

  • 它是“原位”的测量：没有固定相、没有标记、不需要标准品，在溶液里看分子本来的样子，因此能给 SEC 一个独立的第二意见。
  • 先定问题，再定模式：SV 回答“分布与比例”，SE 回答“分子量与亲和力”。实验设计由想回答的问题决定，不由仪器决定。
  • 它是正交复核，不是替代：适合关键样品的复核与争议数据的归因；受运行时间与样品条件限制，常规高通量检测仍以 SEC 为主。

参考文献

  1. U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products. CDER/CBER, August 2014. fda.gov/media/85017/download
  2. ICH. Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. Step 4, March 1999.
  3. 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（2020 年版）三部：人用重组单克隆抗体制品总论. 北京：中国医药科技出版社, 2020.
  4. Uchiyama S. Aggregates Quantification of Biopharmaceuticals in a Wide Range of Sizes Using Orthogonal Methods. American Pharmaceutical Review, 2019. americanpharmaceuticalreview.com
  5. Carpenter JF, Randolph TW, Jiskoot W, Crommelin DJ, Middaugh CR, Winter G. Potential inaccurate quantitation and sizing of protein aggregates by size exclusion chromatography: essential need to use orthogonal methods to assure the quality of therapeutic protein products. J Pharm Sci. 2010;99(5):2200–2208. doi:10.1002/jps.21989
  6. den Engelsman J, Garidel P, Smulders R, et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm Res. 2011;28(4):920–933. doi:10.1007/s11095-010-0297-1
  7. 中国食品药品检定研究院. 沉降速度法分析型超速离心测定单克隆抗体分子大小变异体的方法建立与验证.（完整书目信息更新中）
  8. Schuck P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biophys J. 2000;78(3):1606–1619. doi:10.1016/S0006-3495(00)76713-0
  9. Uchiyama S, Noda M, Krayukhina E. Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation for characterization of therapeutic antibodies. Biophys Rev. 2018;10(2):259–269. doi:10.1007/s12551-017-0374-3
  10. Best Practices for Aggregate Quantitation of Antibody Therapeutics by Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation. J Pharm Sci. 2022;111(7):2121–2133. doi:10.1016/j.xphs.2021.12.023
  11. Berkowitz SA. Role of analytical ultracentrifugation in assessing the aggregation of protein biopharmaceuticals. AAPS J. 2006;8(3):E590–E605. doi:10.1208/aapsj080368