EMA《合成多肽开发与生产指南》要点：杂质阈值、表征与正交分析要求

1 基本信息

2 杂质：分类与阈值

• 阈值：肽相关杂质在 0.1% 以上报告、0.5% 以上鉴定、1.0% 以上界定，指南引述 Ph. Eur. 2034 为依据；ICH Q3A/B 不适用。
• 共流出与未分离的峰：多个杂质合成一个峰时，除非另有论证，按合并后的峰应用阈值。
• 指南列出的肽相关杂质类型：立体异构体（差向异构化）、缺失序列、截短（乙酰化）序列、插入序列；降解产物如氧化、水解、异构化、脱酰胺、天冬酰亚胺、二酮哌嗪和焦谷氨酸；以及聚集体、二聚体、寡聚体等高分子量杂质。
• 非肽杂质：工艺试剂、残留溶剂、元素杂质、致突变杂质与亚硝胺。

3 质量标准与结构表征

• 高分子量杂质：须按类型（如二聚体、聚集体）写入质量标准，只写「高分子量杂质」一项不被接受；指南在此处提到的方法是 SEC。
• 鉴别：建议至少两种正交方法；杂质方法须研究稳定性指示能力和物料平衡，并能达到 0.1% 的报告阈值。
• 结构表征：一级结构用 MS、LC-MS/MS、氨基酸分析、NMR、Edman 降解；二级结构用远紫外 CD、FTIR、NMR，三级结构用近紫外 CD、NMR；聚集可用 ThT 染料法和色氨酸内源荧光。
• 其他：反离子含量需有论证的上限；含量一般按无反离子、无水物计；放行和稳定性一般不要求生物活性测定。

4 以生物来源产品为参照的合成多肽（第 6 节）

这是对多肽仿制影响最大的一节。化学合成的多肽不能走生物类似药路径，而是要与从欧盟市场采购的参照产品做对比：

1. 结构：覆盖一级和高级结构的完整分析，高级结构方法包括 CD、FTIR、二维 NMR、荧光和 DSC。
2. 纯度：用按大小、电荷、疏水性分离的正交方法；相关时加做 ThT 法。
3. 杂质：0.1–0.5% 的每个肽相关杂质逐一与参照产品比较；参照产品中没有的杂质不得引起免疫原性担忧，超过 1.0% 须界定。
4. 免疫原性：可参考计算机 T 细胞受体结合预测或体外 T 细胞活化试验。
5. 强制降解：做比较性研究，包括剪切/机械应力。
6. 功能：应使用细胞法试验。
7. 稳定性：有效期不能从参照产品推导。

5 临床试验用药（第 7 节）

• 从早期开始监测氨基酸构件中的单个杂质，II/III 期再按关键性设限度。
• I 期可用已有知识评估高分子量杂质风险，II/III 期须有实验数据。
• 超过 1.0% 的肽相关杂质须鉴定并在非临床研究中界定；尽早使用正交方法和稳定性指示方法。

6 对分析工作意味着什么

1. 高分子量杂质按类型控制

   第 4.4 节

   建议的数据包

   聚集体类型与含量

   方法

   SEC 定量，另用不依赖色谱柱的方法确认聚集体类型（指南未点名 AUC，这是我们建议的正交复核）

   Quickgene 可提供

   SV-AUC 聚集与自缔合分析

2. 高级结构对比

   第 4.3、6 节

   建议的数据包

   二级、三级结构的量化相似性（相关系数、RMSD）

   方法

   远/近紫外 CD

   Quickgene 可提供

   圆二色谱表征

3. 按电荷分离的正交纯度

   第 6 节

   建议的数据包

   电荷变异体分布与表观 pI 对比

   方法

   icIEF

   Quickgene 可提供

   icIEF 分析

4. 细胞法功能试验

   第 6 节

   建议的数据包

   受体激活量效曲线与相对效价

   方法

   报告基因细胞法

   Quickgene 可提供

   细胞法效价测定；CHO-GLP-1 报告基因细胞株

5. 0.1–0.5% 杂质逐一比对

   第 6 节

   建议的数据包

   已知杂质定位与方法专属性

   方法

   RP-HPLC、LC-MS，配合杂质对照品

   Quickgene 可提供

   司美格鲁肽、替尔泊肽、瑞他鲁肽杂质标准品

6. 参照产品中没有的杂质须评估免疫原性

   第 6 节

   建议的数据包

   杂质免疫原性数据

   方法

   用高纯度杂质做体外 T 细胞活化试验

   Quickgene 可提供

   定制合成高纯度杂质，供免疫原性试验使用

7 常见问题

• 这份指南和 Ph. Eur. 2034 是什么关系？ 指南采用 2034 的 0.1% / 0.5% / 1.0% 阈值，并在此基础上补充了共流出峰、高分子量杂质和生物来源参照产品对比等多肽专属要求。
• 和美国 FDA 的要求有何不同？ FDA 2021 年指南只针对 5 个参比为重组来源的仿制药，重点是与参比制剂逐个比对杂质，新增杂质不得超过 0.5%；EMA 指南覆盖新药、仿制和临床用药的全过程。三地对照见合成多肽法规要求总览。

参考文献