圆二色谱的二级结构定量：参考谱库、浓度归一与构象相似性判据的边界

1 引言

在高级结构表征的方法组合里，CD 的位置很特殊：它是最早被引入、最容易做、也最容易被过度解读的一项。一台 CD 仪、一支石英比色皿、一次氮气吹扫，半小时就能得到一条谱；软件点一下「拟合」，就得到四个百分比。整个过程中没有一步会报错，于是这四个百分比常常被当作测量结果写进报告。

但这条链上至少有四个环节会引入实质性的不确定度，且都不会报警：

• 参考谱库。拟合的前提是「未知谱 = 若干已知结构谱的线性组合」。这个前提在球状蛋白上大致成立，在富含 β-折叠的抗体上则不那么成立——参考库里缺乏与抗体可变区、Fc 区高度同源的谱。
• 算法。不同算法对同一张谱给出不同结果，差异常见于 5–10 个百分点。这不是程序写错了，而是它们对「解」的约束不同。
• 浓度。平均残基椭圆度以浓度为分母，浓度错了多少，报告出的 [θ]_MRW 就错多少，且方向一致。需要注意的是：拟合得到的百分比主要由谱形决定，对整体缩放并不敏感——所以浓度误差不会让四个数字变得「离谱」，却会让绝对值、绝对强度比对与跨样品可比性整体偏移，属于最难发现的一类偏差。
• 仪器量程。远紫外区（尤其 190–200 nm）光通量很低，若氮气吹扫不足或光源老化，测到的可能是噪声而不是信号。这个问题的表现形式是「谱线看起来仍然平滑」。

本文的目的是把这四个环节拆开，给出每个环节的判断依据与报告要求。

2 技术原理

2.1 圆二色性的物理来源

手性分子对左旋与右旋圆偏振光的吸收系数不同，差值 ΔA = A_L − A_R 称为圆二色性。仪器实测的是两束光的强度差，换算为椭圆度 θ（单位毫度，mdeg）：θ = 32980 × ΔA。

CD 信号只在有手性环境的发色团上出现。蛋白质中满足条件的主要是肽键（远紫外有跃迁）与芳香族侧链（近紫外有跃迁）。这一物理来源决定了 CD 的两个天然分区：

• 远紫外（190–250 nm）：信号来自肽键的 n→π* 与 π→π* 跃迁，反映肽链骨架的规整排列，即二级结构。
• 近紫外（250–320 nm）：信号来自苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸侧链与二硫键，反映这些残基所处的微环境，即三级结构。

两个分区的信息性质完全不同，不能互相替代。

2.2 远紫外：二级结构的线性叠加

三种基本二级结构在远紫外有各自的特征谱形：α-螺旋呈 208 nm 与 222 nm 的双负峰且强度相近；β-折叠在 216–218 nm 呈负峰、并在 195 nm 附近转正（其谱形随平行/反平行类型与链长变化较大，是三类中最不「标准」的一类）；无规卷曲在 200 nm 附近有强负峰，随后向短波正转。

蛋白质的实测谱是这些组分的加权叠加，权重即各组分的残基比例。这正是拟合反演的物理基础：给定一组已知结构的参考谱，寻找一组非负权重使加权和逼近实测谱。

线性叠加有一个直接推论，也是 CD 最大的局限：它只对「量的变化」敏感，对「位置的变化」不敏感。一个残基从 α-螺旋的第三个位置移到第四个位置，或者一个糖基化位点改变，只要二级结构的总体比例不变，CD 谱就基本不变。CD 看不到「构象细节」，只能看到「构象构成」。

对 α-螺旋还有一个附加判据：222 nm 与 208 nm 的椭圆度比值。比值小于 1（典型 0.8–0.9）提示单链螺旋；比值明显大于 1（常在 1.1 以上）提示螺旋之间发生 coiled-coil 式缠绕。这个比值在融合蛋白与多肽的结构判断中有实用价值。胶原类蛋白另有一套判据：完整三螺旋在远紫外呈「正峰 220–225 nm + 负峰 196–198 nm」，以正负峰强度比 R_pn（θ₂₂₁/θ₁₉₈ 的绝对值之比）表征三螺旋完整性（完整胶原约 0.10–0.15，变性后降至 0 或转负）¹¹。这是 CD 少数几个能给出「有/无特定结构」二元判断的场景，比百分比拟合更稳健。

2.3 近紫外：芳香残基与二硫键的三级结构窗口

近紫外 CD 的信号强度比远紫外低一到两个数量级，但信息性质不同：它反映的是芳香族残基所处环境的极性、柔性以及与邻近基团的相互作用。

关键特征是谱形而非强度。当蛋白的部分结构展开、芳香残基从疏水内核暴露到水相，近紫外 CD 的峰位与相对强度会改变，而远紫外可能几乎没有变化。因此在 HOS 证据链中，近紫外 CD 与内源荧光承担同一个层次（三级结构），二者可互证。

近紫外 CD 的实际困难是信噪比：为获得可用信号，浓度需提高到 0.5–1 mg/mL、光程用 10 mm，这又带来聚集与内滤效应的风险。因此近紫外数据的重现性通常低于远紫外，在可比性研究中的权重也应相应降低。

2.4 热变性曲线与熔解温度

固定波长（通常取 222 nm，因 α-螺旋在此有最强信号）连续升温，记录椭圆度随温度的变化，得到 S 形变性曲线。曲线拐点或一阶导数极值即熔解温度 T_m。

三点需要注意：其一，222 nm 单波长只能反映 α-螺旋的消失。对以 β-折叠为主的蛋白（如 IgG），222 nm 的信号变化幅度小，T_m 的判定精度随之下降，此时可改用 208 nm 或全谱多波长主成分分析。其二，T_m 是热力学量，不是稳定性判据的全部——T_m 高说明去折叠需要更多能量，但不说明在储存温度下不会聚集，后者由动力学决定，需用 DLS 的聚集起始温度 T_on 补充。其三，升温速率影响表观 T_m，速率快时体系来不及达到平衡，表观 T_m 偏高；方法中须固定速率（通常 1 ℃/min）并声明，跨实验室比较时速率不一致则不可比。

3 实验方法

3.1 浓度、光程与氮气

注：浓度与光程须联合选择，不能各自取值。表中浓度区间对应 1 mm 光程；若改用 0.1 mm 光程，为保持同等吸光度，浓度需相应提高约一个数量级（通常 1–2 mg/mL，此时须关注聚集）。该对应关系应写入方法，并在仪器确认时实测验证。

氮气吹扫不是可选项。氧气在 200 nm 以下有明显吸收（185–190 nm 尤强），若吹扫不足，测得的「蛋白信号」里会混入氧气吸收，表现为 190–200 nm 段的异常负偏与噪声增大。判据不是「谱线是否平滑」——这类干扰往往并不表现为尖峰或跳变，看起来完全正常——而是同一样品在充分吹扫前后的谱图比对：若吹扫后 190–200 nm 段的椭圆度绝对值变小、噪声下降，说明此前存在氧气干扰。

光程的选择与浓度耦合：浓度 0.2 mg/mL 配 1 mm 光程，与 0.1 mg/mL 配 2 mm 光程，蛋白的吸收相同、信号相同，但后者把缓冲液与溶解氧的吸光度一并放大了一倍，总吸光度更高、杂散光误差更大。因此在信号足够的前提下，优先选短光程高浓度；代价是高浓度一侧的聚集风险上升，须以浊度或 DLS 佐证。

3.2 HT 电压：远紫外数据的可用性判据

这是本节最重要的一条实操判据。

CD 仪在扫描过程中同步记录光电倍增管的高压（HT，high tension）值。当光通量充足时，HT 维持在较低水平（常见 300–600 V；部分仪器以 kV 显示，须先换算再比对）；当光通量不足（短波端光源弱、样品吸收强、比色皿吸收）时，仪器自动提高 HT 以维持信号，此时噪声同步放大¹²。

由此得到一条方法设计原则：先扫 HT，再定低波长截止点。若 HT 在 200 nm 已超过阈值，则拟合区间应设为 200–250 nm，而不是硬套 190–250 nm。

3.3 参数设置与系统适用性

扫描参数（响应时间、带宽、步长、累加次数）参照行业标准 JY/T 0572—2020《圆二色光谱分析方法通则》执行²。带宽与步长需匹配：带宽过大平滑掉窄峰，步长过大使峰位失真。

系统适用性用标准物质校验：樟脑磺酸铵（ammonium camphorsulfonate，ACS）在 290.5 nm 有确定的比椭圆度（文献值 [θ] ≈ +7 260 deg·cm²·dmol⁻¹），用于校验仪器的椭圆度标尺；其远紫外特征也可用于波长准确度校验。每次测定随行一次，确认示值偏差在允许范围内。具体标准物质、浓度与限度须在方法中自行规定并验证——行业标准只给出原则性要求，不指定具体物质。

4 数据分析与归一化处理

4.1 平均残基椭圆度的计算与浓度依赖

原始数据是椭圆度 θ（mdeg），它随浓度与光程线性变化，因此不能直接跨样品比较。归一化的方式是换算为平均残基椭圆度：

[θ]_MRW = θ × MRW / (10 × c × l)

其中 MRW 为平均残基分子量（分子量除以残基数），c 为浓度（mg/mL），l 为光程（cm）；按此式算得 [θ]_MRW 的单位为 deg·cm²·dmol⁻¹。当 θ 用 mdeg 输入时，数值上等于「mdeg·cm²·dmol⁻¹」，报告时须换算或注明单位，这是跨实验室比对时最常见的错位来源之一。

这个式子里，MRW 由序列确定，l 由比色皿标称值确定，只有 c 需要实测。而 c 的常规来源是同一份样品的 A280 除以消光系数。于是形成一条链：

CD 谱 → [θ]_MRW → c → A280 → 消光系数 ε → 氨基酸组成实测

这条链的含义是：[θ]_MRW 的绝对值与 ε 的不确定度是 1:1 传递的——ε 偏差 5%，所有归一化后的椭圆度值同步偏差 5%，而谱形完全不变，在 CD 图上看不出来。需要强调的是，这一偏差不等于拟合百分比的同比例偏差：百分比主要由谱形及各组分参考谱的相对幅度决定，对整条谱的整体缩放并不敏感（三类算法都在「组分之和 = 1」的约束下求解，拟合结果更多取决于谱形而非绝对幅度），因此浓度误差对组分比例的影响是部分的、非等比的，通常明显小于 1:1。它的破坏性恰恰在于「不报警」：绝对值失真、绝对强度类判据失真（θ₂₂₂/θ₂₀₈、R_pn、单点椭圆度阈值），以及跨批次、跨实验室的可比性整体偏移，都不会在谱图或拟合质量指标上留下痕迹。

实操上因此有三条要求：CD 与 UV 必须用同一份稀释液、同一次浓度测定；报告 CD 结果时须同时给出浓度及其来源；对精度要求高的可比性研究，宜先用氨基酸组成实测消光系数，再以此浓度归一。

4.2 拟合算法的选择与不确定度

用于二级结构拟合的算法有若干种，主流的三类在原理上就有差别：SELCON3 以基函数的最小二乘拟合为核心，对参考集做自洽检验；CONTINLL 用带正则化的 ridge 回归，对噪声更稳健，倾向于给出较平滑的解；CDSSTR 先对参考集做奇异值分解降维，再在低维空间拟合，对参考集覆盖度依赖较强。

三者的差别不是精度高低，而是对「解」的约束不同：是否允许组分之和偏离 1、是否允许存在未解释的残基、正则化强度如何取。因此同一张谱经三者处理，α-螺旋比例出现 5–10 个百分点的差异属正常范围¹⁰。参考集的覆盖度与版本同样影响结果，Whitmore 与 Wallace 曾系统比较过不同参考库在同类蛋白上的表现⁹；Greenfield 的综述则给出了从谱到二级结构的完整操作框架⁸。

由此得到两条方法学要求：其一，方法中必须固定算法与参考集，不能「换一个软件重算看看」——换算法等于换方法。其二，报告必须给出拟合的质量指标：拟合残差（NRMSD）、各组分之和对 1 的偏离、以及所用参考集名称。只给四个百分比而不给这些指标，读者无法判断结果的可信度。

4.3 相似性比较的量化口径

可比性研究中的常见做法是把两条 CD 谱叠在一起看「是否重合」。这个做法需要量化，否则结论依赖主观。可用的量化指标有三类：

谱图相关系数——逐波长计算两条谱的 Pearson 相关系数，值越接近 1 越相似。缺点是对整体强度差异不敏感：两条谱形状相同但幅度差 10%，相关系数仍接近 1。

差值谱的均方根（RMSD）——逐点相减后取均方根，能反映幅度差异，但对单点异常敏感。

拟合组分之差——分别拟合后比较各组分比例，给出差值及其不确定度。这是最贴近「结构差异」的指标，但受算法不确定度制约。

实践中宜三者并用：相关系数确认谱形，RMSD 确认幅度，组分差确认结构。仅报其中一项都不足以支撑结论。

5 结果与讨论

5.1 三种算法的分歧有多大

以一条典型 IgG 的远紫外谱为例，用三种算法分别拟合，α-螺旋比例的差异常见于 5–10 个百分点，β-折叠的差异相对较小（因 IgG 以 β-折叠为主，参考集覆盖较好），而转角与无规卷曲的分配差异往往同样大甚至更大——这两类结构在参考谱中本身就难以清晰区分，算法对它们的分配带有相当大的自由度。两者合计（转角 + 无规）通常比单一组分的波动更稳定，因此有作者主张只报「α-螺旋 / β-折叠 / 其余」三分法。

这个事实的方法学意义是：「α-螺旋 18%」这个数字的有效位数只有一位。报「18.3%」是把算法不确定度当成了测量精度。规范的做法是报区间或报「约 18%」，并在方法中声明算法与参考集。

5.2 为什么 IgG 的 CD 谱「看起来都一样」

这是 CD 在抗体表征中最常被误用的一点。IgG 的二级结构以 β-折叠为主（CD 拟合常报 40%–45%，具体数值随算法与参考集浮动，见 4.2），且这一构成在不同 IgG 之间相当稳定。糖基化改变的是 Fc 区两个 C_H2 结构域附近的局部环境，涉及数个残基；这些残基在远紫外谱中的贡献被整体的 β-折叠信号淹没。

结果就是：两条谱重叠得很好，但这不证明构象相同。差异可能存在于近紫外区（芳香残基微环境）、可能存在于热稳定性（T_m 差 1–2 ℃）、也可能存在于局部柔性（氢氘交换率），而远紫外 CD 对这些都不敏感。

5.3 与 FTIR 的正交互证

CD 与 FTIR 都给出二级结构比例，但两者的物理基础不同：CD 基于电子跃迁的手性差异，FTIR 基于酰胺键的振动偶极。二者的敏感谱带也不同——CD 对 α-螺旋的 222 nm 特征峰很敏感，FTIR 对 β-折叠的 1620–1640 cm⁻¹ 更敏感。

因此两法的一致性具有特殊价值：当 CD 与 FTIR 给出的 β-折叠比例一致时，这个结论比任一方法单独给出时更强。反之，若两法差异明显，提示其中一方受干扰（CD 可能受浓度归一影响，FTIR 可能受水汽干扰），应查原因而非取平均。单一方法给出的组分比例本质上都是估算，这也是许多实验室把「二级结构结论须双法一致方可写入报告」作为内部方法学规则的由来——它是企业自设的质量标准，而非法规明文要求，写进文件时应注明这一属性。

5.4 申报落点与表述纪律

CD 数据在申报中有三个落点，对表述的要求不同。结构确证的落点是 ICH Q6B，可比性研究的落点是 ICH Q5E（生物制品工艺变更的可比性评价）及其实施问答，质量标准的落点则是各品种正文项下的鉴别项：

最常见的表述错误是把鉴别项的口径用到可比性上——「谱图一致」被写成「结构一致」。这两句话的证据强度差一个量级。另一个常见错误是把「未检测到差异」写成「无差异」：前者只代表所用量程与信噪比下的分辨能力，应同时给出方法的分辨力（重复测定的谱间 RMSD、相关系数下限），否则「未检测到」等于无判据。

5.5 方法学验证：按「性能特征」而非「全套项目」设计

ICH Q2(R2) 的框架是按性能特征而非固定清单来设计验证：方法用途决定要验证什么，而不是把所有项目都做一遍⁴。CD 的处境正适合这一思路——它既是定性方法（鉴别、谱形比对），又带半定量的拟合输出，二者需要的证据并不相同。

可操作的切分是：鉴别用途看专属性（强制降解或热变性样品应给出可区分的谱形，阴性对照与缓冲液应无信号）与耐用性（吹扫时间、光程、浓度 ±10%、升温速率、不同比色皿批次）；半定量用途加做重复性（同一样品连续 6 次，报 θ 与各组分比例的 RSD）与中间精密度（不同日、不同操作者）。线性一项须谨慎：椭圆度固然与浓度成正比（Beer–Lambert），但方法的输出是拟合比例，而比例并不随浓度变化——把线性列为验证项既不对应方法的实际用途，也容易在核查时被追问依据。至于准确度，二级结构比例没有公认真值，只能用参考蛋白或与 FTIR、晶体结构对照的方式间接支持，不宜强行给出回收率。

系统适用性则每次随行：ACS 校验椭圆度标尺、HT 曲线确认低波长截止点、基线噪声（RMS）不超过方法规定值。这三项都便宜、都快，且都能独立于结果「报警」——它们比事后检查谱线形状有用得多。

6 药典与标准对照

三部药典均未为电子 CD 设立独立通则^1,6,7。需要注意的两点：其一，USP 2025 设有〈782〉振动圆二色谱（VCD）专章，但 VCD 测的是振动跃迁（可用于区分手性异构体、辅助构象归属），与基于电子跃迁的远紫外 CD 不是同一技术，不能相互援引；其二，EP 的 2.2.42 是固体密度，与 CD 无关，检索时容易误把章节号当作 CD 专章。

实务中的后果是：CD 的方法依据填不到一条对应的药典通则，只能填行业标准或自建方法，并在方法学验证中自行建立完整的判据体系。这与「申报时把 CD 依据填为通则 0401」的做法有本质区别——0401 是紫外-可见吸收法，光学上不涉及圆偏振光；它至多能在仪器校准、吸光度线性、比色皿匹配这类共性要素上作为参照，但不能充当 CD 的专属依据。把 0401 写成 CD 的方法依据，是审评中容易被直接指出的一处形式缺陷。

7 结论

CD 在 HOS 证据链中的价值是明确的，但它的输出是拟合值而非测量值，这一点必须在方法设计与报告表述中体现。

其一，参考谱库与算法决定结果。同一张谱在不同算法下 α-螺旋可差 5–10 个百分点，故算法与参考集必须固定并随结果报告；「α-螺旋 18%」的有效位数只有一位。

其二，浓度是最隐蔽的误差源。平均残基椭圆度以浓度为分母，而浓度经 A280 与消光系数由氨基酸组成给出——[θ]_MRW 的绝对值因此继承了 UV 与 AAA 的不确定度，且近似 1:1 传递。值得注意的是，拟合百分比对整条谱的整体缩放并不敏感，所以这一偏差不会在百分比或谱形上报警，它污染的是绝对强度类判据（θ₂₂₂/θ₂₀₈、R_pn、单点椭圆度阈值）与跨批次、跨实验室的可比性。

其三，HT 电压是远紫外数据可用性的客观判据，而非谱线平滑度。HT 超过阈值的波段不可用于定量拟合，截止波长应据 HT 曲线确定。

其四，谱形相似不等于构象相同。IgG 的 CD 谱高度相似，糖基化等局部变化在测量误差之内；CD 谱重叠只能支持「未检测到显著差异」，且宜与 FTIR、近紫外 CD、内源荧光、DSC 等组合构成 HOS 结论。

参考文献