毛细管等电聚焦的电荷异质性定量：pI 校准、聚焦完成度与峰面积口径的边界

1 引言

电荷异质性通常由两个方法覆盖：阳离子交换色谱（CEX）与毛细管等电聚焦（cIEF / icIEF）。两者在申报资料里常被并列写成「两种方法测定电荷变异体，结果一致」，这句话在方法学上是有问题的——它们测的不是同一件事。

CEX 分离的依据是蛋白与带负电固定相之间的静电作用强度，输出是一个保留时间。这个保留时间依赖于柱批次、盐梯度斜率、pH、柱温，任何一项改变都会平移峰位。因此 CEX 的「酸性峰占比」是一个在特定分离体系下成立的相对量，跨实验室比对需先做系统适用性。

icIEF 分离的依据是蛋白自身净电荷为零的那一点，输出是 pI。pI 主要由分子的一级结构与翻译后修饰决定，因此在方法条件受控时便于跨批次比较；但报告值是经标志物校准的表观 pI，不同平台、两性电解质与标志物组合下仍可能出现系统差异，跨仪器、跨实验室比对需以方法条件和系统适用性为前提。这是 icIEF 的价值所在，也是它在放行与可比性研究中被赋予较高权重的原因。

但这条链上有四个不报警的环节：

pI 不是读出来的，是算出来的。仪器记录的是峰在检测窗口中的像素位置，pI 由标志物回归换算。标志物选得不对、覆盖范围不够、回归质量差，pI 就不可信，而软件不会提示。

聚焦是否完成没有客观标志。电压加上去，电流会下降，但「降到多少算聚焦完成」需要判断。聚焦不足与聚焦过度都会给出可读的峰，也都会给出错误的 pI 或偏宽的峰。

归一化的分母没有被审视。峰面积归一化法要求分母是「所有蛋白峰面积之和」。系统峰、标志物峰、基线伪峰若被计入，分母变大，所有百分含量等比例偏小。

检测波长隐含一个假设。icIEF 在 280 nm 检测，各电荷变异体的摩尔吸光系数并不严格相等，归一化隐含「响应因子一致」。

本文把这四个环节拆开，给出每个环节的判断依据与报告要求。

2 技术原理

2.1 聚焦：pH 梯度的建立与蛋白的自我定位

毛细管内充入载体两性电解质（carrier ampholyte），两端分别浸入酸性的阳极液与碱性的阴极液。加电压后，两性电解质按其 pI 在管内排序，形成一个从阳极到阴极连续上升的 pH 梯度。

蛋白进入这个梯度后，若处于比自身 pI 更酸的位置，则带正电，向阴极迁移；若处于更碱的位置，则带负电，向阳极迁移。两种迁移都把它推向「净电荷为零」的那一点，到达后不再迁移，扩散与聚焦达到平衡，形成一条窄带。

这个「自我定位」机制有三个直接推论：

• pI 是位置信息，不是强度信息。峰高的重现性远不如峰位，因为峰高受进样量、吸附、检测器线性影响，峰位只受梯度影响。
• 聚焦是动态平衡，不是静态沉积。带宽是聚焦（收窄）与扩散（展宽）竞争的结果，因此聚焦时间存在一个适宜范围；超过之后，带宽可能因热效应、梯度漂移等原因重新变宽。
• 梯度由两性电解质建立，因此梯度的线性是有限度的。商品化两性电解质在极端 pH 端（<3 与 >10）梯度变陡，分辨率下降。这是「极端 pI 蛋白回收率与分辨都变差」的物理原因。

2.2 pI 是回归量：标志物、像素与线性

通则 3129 对 pI 的计算规定得很明确：以各等电点标志物的 pI 对其相应像素值作线性回归，将电荷变异体的像素值代入回归方程求出其 pI。

这句话包含三层约束，每一层都可能失效：

标志物必须跨骑目标。若目标 pI 落在最高与最低标志物之间，是内插；落在之外，是外推。外推的不确定度随距离增大而迅速放大，且无法用回归的 R² 反映——R² 只说明标志物本身拟合得好，不说明外推区间可靠。

标志物的 pI 值是标称值。标志物本身也有不确定度（通常 ±0.05 pH 量级），这会作为系统偏差传递到所有结果。跨批次比对时，若两批使用不同厂家的标志物，pI 的系统偏差可达 0.05–0.1 pH，足以吞掉真实的微小位移。

像素到 pH 的线性只在梯度线性区内成立。梯度两端可能偏离线性，线性回归会把这种系统弯曲平均掉。标志物残差呈「两端为正、中间为负」时，提示可能存在系统性弯曲；是否确实来自梯度两端变陡，需要更多标志物或独立数据确认。在确认之前，宜缩小使用区间，而不是继续用整条回归线。

2.3 分辨能力：0.02 pH 是特定条件下的典型值

通则 0542 指出，采用载体两性电解质制备的凝胶通常可分离 pI 相差约 0.02 个 pH 单位的蛋白，采用固相 pH 梯度可进一步提高分辨率。这是特定凝胶 IEF 条件下的典型分辨能力。

这个数字适合作为判断的参考起点，而不是适用于所有毛细管方法和样品的固定边界。实际分辨能力应以具体样品和方法数据为准。它提示：

• 相邻两峰的 ΔpI 越接近方法的实际分辨能力，提高电压或延长聚焦就越难把它们分开，往往只会让峰一起变宽；
• 当报告声称「检出五个酸性变异体」时，首先应问的不是积分参数，而是相邻峰的 ΔpI 是否在该方法已证实的分辨能力之上；
• 多个修饰叠加、相邻组分 ΔpI 很小时，峰形可能表现为「变宽」而非「分叉」——这是一个容易被误读的形态。能否分辨应以方法开发中的分离度数据为依据，而不是由修饰类型推断。

2.4 280 nm 检测隐含的响应因子假设

icIEF 在 280 nm 检测蛋白。通则报告的是指定检测条件下的相对峰面积；把相对峰面积当作摩尔比例，前提是各峰的摩尔吸光系数相同。

对完整 IgG 的电荷变异体，这个假设近似成立：脱酰胺、C 端赖氨酸残留、N-糖末端唾液酸化这些修饰只改变少数残基或糖基，对 280 nm 的吸收贡献变化通常在百分之几量级，小于积分本身的不确定度。

但这个假设有明确的失效场景：

• 含片段的样品。Fab 与 Fc 的芳香残基组成差异大，摩尔吸光系数不同；若样品中同时存在完整分子与片段，面积比会系统性偏离摩尔比。
• 糖型差异显著的样品。糖基不吸收 280 nm。糖型造成的分子量差异，主要影响由摩尔比例换算质量比例这一步；单凭分子量差异，不能推出 280 nm 摩尔响应发生改变。
• 聚集体。聚集体的 280 nm 响应受散射影响，表观吸光度偏高。

因此，「相对峰面积等于摩尔比例」应作为前提写入方法局限，而不是默认成立。

3 实验方法

3.1 通则 3129 第一法的条件要素

《中国药典》2025 年版四部通则 3129 规定，单抗电荷变异体测定采用全柱成像毛细管等电聚焦电泳（icIEF，第一法）或毛细管等电聚焦电泳（cIEF，第二法），依据各电荷变异体的等电点特征，按毛细管电泳法（通则 0542）分离，测定 pI 并计算百分含量。第一法的要素如下：

两处细节值得单独说明。

甲基纤维素不是辅料，是抑流剂。它提高溶液黏度、抑制电渗流与对流，使聚焦形成的窄带不被流体扰动抹平。配制不当（溶解不完全、浓度偏差）的表现是峰宽增大而 pI 未必偏移——这与聚焦不足的表现相似，容易误判。

样品室 4–10 ℃ 与毛细管 18–25 ℃ 是两个不同的温控点。前者防止样品在等待进样时降解或聚集，后者决定聚焦时的电导与黏度。把样品室温度调低以「保护样品」是合理的，但若同时降低了毛细管温度，聚焦动力学随之改变，聚焦时间需重新确认。

3.2 脱盐：为什么是必要步骤而不是可选项

通则 3129 明确：供试品盐浓度较高时须脱盐前处理。

原因在于电导。聚焦时毛细管内的电流由载体两性电解质与样品中的离子共同承担。样品带入高浓度盐，则：

1. 施加电压固定、毛细管长度不变时，平均场强由电压与长度决定；但高盐会提高电导与电流，改变局部场强分布、热负荷与梯度形成，聚焦可能在给定时间内无法完成；
2. 电流增大使焦耳热负荷上升，热区内黏度下降、扩散加剧，带宽增大；
3. 盐离子在梯度中重新分布，局部 pH 被扰动，pI 读数偏移。

三者叠加的表现是「峰变宽、pI 略偏、重现性差」。这类问题常被归因于「柱子脏了」或「批次差异」，实为基质问题。

脱盐的目标不是「除尽盐」，而是把电导降到方法可接受的水平。这个水平应在方法开发阶段用加盐回收试验确定：向同一份样品中加入递增浓度的 NaCl，观察 pI 与峰宽何时开始偏离，该浓度即方法的耐盐上限，写入 SOP。

3.3 序列与系统适用性

通则 3129 规定：系统适用性溶液、空白溶液、对照品溶液、供试品溶液依序进样；系统适用性溶液在序列起始至少 2 针、序列尾至少 1 针，空白与对照品各 1 针。

三处设计意图：

• 起始至少 2 针是为了区分「首针效应」与「真实结果」。首针常因毛细管壁未平衡而峰形异常，两针的差异本身就是可用的信息。
• 序列尾至少 1 针是为了捕获漂移。若尾部结果与起始显著不同，说明整个序列的数据都需重新评估，而不是只质疑尾部样品。
• 空白在系统适用性之后、对照品之前，是为了先确认积分区域干净。通则要求空白图谱中两个等电点标志物均被检出，且标志物峰之间的供试品积分区域应无干扰积分的倒峰、尖峰等非蛋白峰。这一条直接关系到下文 §4.2 的分母。

3.4 第一法与第二法的取舍

第一法（icIEF）为全柱成像，一次曝光获得整根毛细管的 pI 分布，无迁移过程，因此没有「迁移时间漂移」这一误差源，重复性通常优于第二法。第二法（cIEF）需在单一检测窗口逐点扫描，聚焦完成后施加化学动员或压力动员把梯度推过检测窗，动员过程会引入额外的峰形展宽。

在没有 icIEF 仪器的实验室，第二法仍是可行路径，但需在方法中额外确认动员条件（动员压力或化学动员剂浓度）对 pI 读数的影响，并把该影响计入方法的不确定度。

4 数据分析与积分处理

4.1 pI 回归的四个记录项

pI 的可靠性由回归决定，而回归的质量必须被记录，不能只写一个结果数字。方法中应固定记录四项：

其中「残差模式」是最容易被忽略、也最有诊断价值的一项。R² 对系统弯曲不敏感——五个点弯成一条弧，R² 仍可达到 0.999。残差的符号分布可以提示系统性弯曲；弯曲来自梯度非线性还是标志物本身，需要结合更多标志物或独立数据判断。

4.2 归一化的分母：哪些峰算蛋白峰

通则 3129 规定百分含量按峰面积归一化法计算：各电荷变异体峰面积占所有蛋白峰面积之和的百分比。

关键在于「蛋白峰」的界定。以下四类物质在电泳图上都会出峰，但性质不同：

• 供试品的电荷变异体：应计入分母。
• 等电点标志物：不应计入。标志物是外加的内标，其峰位用于回归，其面积与样品含量无关。
• 系统峰：由载体两性电解质、甲基纤维素或毛细管涂层产生，不应计入。通则要求空白图谱在积分区域无干扰峰，正是为了把这类峰排除在外。
• 基线伪峰：由气泡、颗粒、检测器噪声产生，表现为极窄的尖峰或极性反转的倒峰，不应计入。

分母污染的后果是单向的：多计一个峰，所有百分含量等比例偏小，主峰纯度被系统性稀释。这种偏差可能逃过仅监控主峰 pI 与百分含量的指标；通则对空白干扰峰和图谱相似性的要求，正是为了在流程上加以防范。

4.3 酸性峰、主峰、碱性峰的分界

三个分区的分界必须由方法预先定义，不能由积分软件按峰形自动判断。通行做法是以主峰的 pI 为界：pI 小于主峰者为酸性变异体，大于主峰者为碱性变异体。

这个定义有一个隐含前提：主峰本身是「未修饰」的组分。若样品的主体已被修饰（例如高脱酰胺样品），主峰可能已不是理论 pI 对应的组分，此时「酸性/碱性」的语义应重新审视，报告中宜直接给出各峰的 pI 与占比，而不只是一个「酸性峰占比」。

分界点还应固定到小数点后两位，并写入方法。分界点移动 0.05 pH，酸性峰占比可变化数个百分点，而这一变化与样品无关。

4.4 判断聚焦完成度：多指标联合观察

这是本节最需要强调的一点：聚焦时间不能照抄，必须按样品确认。通则给出 4.5–15 min 这样宽的区间，说明终点需要结合样品与方法确定。

方法开发中可联合观察的指标：

电流趋稳。随着梯度建立、两性电解质趋于聚焦，管内电导下降，电流随之下降。当电流接近稳定值（相邻采样的变化小于预设阈值）时，提示聚焦接近完成；电流仍在明显下降就终止，可能聚焦不足。

主峰宽度、表观 pI 与关键峰分离度。连续记录主峰半高宽、主峰表观 pI 和关键相邻峰的分离度随聚焦时间的变化。三者都趋于稳定的区段，才是选择终点的依据；若峰宽回升，应结合 pI 漂移、电流和样品基质排查原因，而不是直接归因于某一机理。

任何单一指标都不足以判断：只看电流会漏掉峰宽或 pI 仍在变化的情形；只看峰宽会漏掉电流仍高、基质尚未平衡的情形。

4.5 报告必填项

一份可用于申报的 icIEF 报告，除结果数字外应包含：

1. 标志物清单与各自的标称 pI、批号；
2. 回归方程及目标 pI 相对标志物区间的位置（内插 / 外推）；
3. 积分区域边界（以标志物峰位定义）；
4. 酸性/主/碱性峰的分界 pI 及该分界的设定依据；
5. 系统适用性三针的主峰 pI、主峰百分含量及其 SD / RSD；
6. 空白图谱（证明分母洁净）；
7. 响应因子一致性的假设及其适用性说明。

七项中，第 2、6、7 项在现有报告中缺失最普遍，也最影响结论的可信度。

5 结果与讨论

5.1 icIEF 与 CEX：同一份样品，两个「酸性」

下面用一个假设示例说明（数值为构造，非实测）：设某重组 IgG1 样品 icIEF 酸性峰为 43.4%，CEX 为酸性 27.0%、主峰 61.7%、碱性 11.3%。

两个数字相差 16.4 个百分点。这未必说明哪一方测错了，一个可能的解释是「酸性」在两个方法里指的不是同一件事：

• icIEF 的「酸性」是 pI 判据：凡 pI 低于主峰者皆为酸性，包括脱酰胺、唾液酸化、C 端赖氨酸缺失等一切降低 pI 的修饰。
• CEX 的「酸性」是保留判据：凡在主峰之前洗脱者皆为酸性，取决于该修饰在特定梯度下能否产生足够的保留差异。

某些修饰可能明显改变 pI 但几乎不改变 CEX 保留（例如净电荷变化小、主要改变表面电荷分布的修饰）；另一些修饰可能在 CEX 上分得很开，但 ΔpI 低于 icIEF 方法的实际分辨能力。两个集合不是包含关系，只是部分重叠。

由此得到两条判读纪律：

不可互校数值，只可互证趋势。若某批样品的 icIEF 酸性峰升高而 CEX 酸性峰未变，不能直接判为「方法不一致」，应先考虑该修饰是否属于「改 pI 不改保留」的类型。两法同时升高可以增强对变化趋势的判断，但确认变异体的身份或总量仍需其他证据（如组分收集与质谱）。

申报中应分别陈述，不作合并。写成「两法结果一致」会掩盖信息；分别给出两法结果，并说明两法对「酸性」的定义不同，才是准确的表述。若引用实测数据，应同时给出样品来源、两法条件、原始图谱和积分口径。

5.2 方法转移：数值指标、图谱相似性与预设转移标准综合判断

通则 3129 明确指出：icIEF 分析仪器品牌不同、毛细管品牌或规格存在差异时，系统适用性对照品的电泳图谱与参考图谱峰型相比可略有差异。

这句话解决了一个在方法转移中反复出现的争议：接收方做出的图谱与转出方不完全一样，能不能放行？

答案是：轻微的峰型差异本身不构成否定，但也不能只看数值、不看图谱。通则的系统适用性要求同时涉及数值指标与参考图谱相似性，并允许不同品牌仪器或毛细管带来轻微峰型差异。转移时应结合以下内容综合判断：

• 系统适用性数值：主峰 pI、主峰百分含量及其 SD / RSD 是否在规定范围内；
• 参考图谱相似性：峰的数目、相对位置与分布是否与参考图谱一致，差异是否仅属峰型的轻微变化；
• 预先设定的转移标准：在转移方案中事先约定的比较指标与接受限度是否满足。

这样既不会因为品牌间难以避免的峰型差异否定方法，也不会把方法转移变成单纯的数字比对或图片比对。

5.3 三类陷阱

陷阱一：pI 外推。目标 pI 落在标志物区间之外时，软件仍会给出一个 pI，且不报警。识别方法：核对标志物清单与目标 pI 的相对位置。处理：更换覆盖范围合适的标志物组合，或在报告中明确标注外推并给出外推距离。

陷阱二：把峰变宽简单归因于某一种原因。聚焦不足、热效应、基质（盐）干扰都可能表现为「峰变宽、重现性差」，处置方向却不同。识别方法：同时查看电流–时间曲线、主峰表观 pI 是否仍在漂移以及关键峰分离度。电流仍在明显下降，提示聚焦可能不足；电流已稳而峰宽和 pI 仍在变化，应排查热负荷、基质和梯度稳定性。处置要建立在证据之上，误判会越调越差。

陷阱三：分母污染。空白图谱中若有未排除的系统峰落入积分区域，分母被放大，所有百分含量偏小。识别方法：每次序列都看空白图谱，而不是只在方法开发时看一次。处理：调整积分区域边界，或更换载体两性电解质批次。

5.4 局限

• 分辨率受梯度线性限制。极端 pI（<3 或 >10）区域梯度陡、分辨率低，落在该区域的变异体只能定性。
• 疏水蛋白与膜蛋白回收率低。聚焦过程中的蛋白-管壁吸附会导致回收率下降，表现为总峰面积偏低而各峰比例未必失真。
• 不能给出修饰类型。icIEF 只按 pI 分组，同一 pI 位置上可能叠加多种修饰。要指认修饰类型，需与肽图、糖谱或 CEX 组分收集联用。
• 响应因子假设（见 §2.4）在含片段样品上可能失效。

6 药典对照

＊ USP、EP 相关章节的编号与现行版本状态，引用前请以最新官方版本核对。

7 结论

1. pI 是回归量，不是直读量。它的可靠性由标志物的覆盖范围与回归残差的模式决定，而非由 R² 单项决定。目标 pI 落在标志物区间内是内插，落在区间外是外推，两者不应在同一份报告中以同等权重出现。
2. 聚焦完成度是状态量，不是时间量。应在方法开发中联合观察电流趋稳、主峰宽度、表观 pI 稳定性和关键峰分离度来确定终点。通则给出的 4.5–15 min 是范围，不是推荐值。
3. 百分含量是口径量。分母的构成由积分区域边界与空白图谱的洁净度共同决定；分母污染导致单向偏差，可能逃过仅监控主峰的指标，需要靠流程预防。
4. icIEF 与 CEX 的「酸性」不是同一集合。两法不可互校数值，只可互证趋势；申报中应分别陈述并说明定义差异。
5. 方法转移应综合判断。结合系统适用性数值、参考图谱相似性及预先设定的转移标准；通则允许不同仪器或毛细管带来轻微峰型差异，但并不意味着可以忽略图谱。
6. 相对峰面积默认各峰在 280 nm 的摩尔响应相同，在完整 IgG 的电荷变异体上近似成立；含片段的样品需单独确认并写入局限。糖型差异主要影响摩尔与质量比例之间的换算。

参考文献